Ki-67、p16及EGFR表达与老年宫颈癌手术患者预后的相关性

马淑云 雷洁 张欣 贾澄辉 张青青 周婷 邓晓红

(1西安医学院第一附属医院/全科医学院临床实验教学中心/妇产科，陕西 西安 710077；2西北妇女儿童医院妇产科)

宫颈癌是女性恶性肿瘤疾病之一，死亡率在女性恶性肿瘤中居第二位，且发病年龄越来越呈现出年轻化趋势〔1〕。Ki-67是一种增殖细胞核抗原，是与细胞周期相关的蛋白质，其功能与有丝分裂有关，是多种恶性肿瘤疾病重要生物标志之一，通过检测Ki-67抗原，能够了解恶性肿瘤的细胞增殖活性，可作为疾病不良预后因素，对疾病诊断治疗及预后评价有着重要的参考价值〔2,3〕。p16基因又称为MTS1基因，该基因直接参与细胞周期调控，承担调节细胞分裂与增殖的作用，宫颈癌患者常伴人乳头瘤病毒(HPV)感染，HPV病毒表达E7蛋白将结合Rb蛋白诱使Rb蛋白失活，失活后的Rb蛋白将对p16基因产生反馈性刺激，导致其表达升高，故p16表达的升高可能与患者预后存在一定联系〔4,5〕。表皮生长因子受体(EGFR)是酪氨酸激酶信号传导通路上的一种蛋白，由原癌基因活化后产生，该蛋白在正常组织与肿瘤疾病中均有表达，与肿瘤发生发展有着密切联系，现有报告指出，90%的宫颈癌患者存在EGFR蛋白过度表达，故该蛋白可能与宫颈癌患者的预后也有一定相关性〔6～8〕。本研究检测了老年宫颈癌患者术后病理标本中的Ki-67、p16、EGFR蛋白表达，并分析了患者临床资料，旨在探讨Ki-67、P16、EGFR表达与患者预后的相关性。

1 资料与方法

1.1一般资料 在获得西安医学院第一附属医院医学伦理委员会批准后，选取2012年5月至2018年9月接受宫颈癌根治术治疗的老年宫颈癌患者50例为研究对象，患者及其家属对本次研究知情，并签署知情同意书。年龄60～87〔平均(71.24±5.69)〕岁；国际妇产科协会(FIGO)肿瘤分期：ⅠB期16例，ⅡA期21例，ⅡB期13例；经术后病理证实：2例为高分化期(G1级)，31例为中分化期(G2级)，17例低分化期(G3级)。年龄：60～65岁3例，66～74岁25例，75～85岁18例，>85岁4例；民族：汉族40例，其他10例；肿瘤直径<10 cm者30例，≥10 cm且≤20 cm者11例，20 cm<且≤30 cm者6例，>30 cm者3例；治疗方法：单纯手术16例，术后化疗7例，术后放疗9例，术后放化疗18例。

1.2入选标准

1.2.1纳入标准 ①全部患者手术切除组织经甲醛溶液固定，并使用白蜡包埋，每个蜡块均实施3～4 μm连续切片并行免疫组化染色；②收集组织白蜡标本均经术后病理证实为明确的宫颈鳞状细胞癌；③患者无其他恶性肿瘤疾病；④患者病变区域在术前均未接受其他放化疗。

1.2.2排除标准 ①其他黏液样癌、腺癌等；②合并皮肌炎、哮喘、系统性红斑狼疮等自身免疫系统疾病者；③有宫颈癌根治术手术禁忌者；④需要接受根治性放化疗治疗者；⑤伴脑梗死、心力衰竭、肾脏损害等基础疾病者。

1.3方法

1.3.1治疗方法 全部患者接受全麻下广泛性子宫切除术与盆腔/腹主动脉淋巴结清扫术。对于术后具有高复发因素的患者应实施全盆化疗，包括盆腔淋巴结转移、宫旁组织浸润、宫颈深肌层侵犯、手术范围不足或手术切缘阳性者。一般盆腔放疗剂量应控制在4 500～5 000 cGy，若患者存在腹膜后区淋巴结转移，给予腹膜后区至少50 Gy的照射剂量。使用直线加速器6 MV X射线进行外照射，照射方式为适形放疗或调强放疗。若患者瘤体直径较大，或发现盆腔淋巴结转移、手术前切缘阳性、侵及淋巴脉管间隙、低分化肿瘤及宫旁浸润者，手术前后均给予患者化疗治疗，化疗实施具体方案：75 mg/m2顺铂，分3次静滴，1次/d；联合1 mg/(m2·24 h)5-氟尿嘧啶持续微量泵泵入4 d。

1.3.2检测方法 病理组织标本取材后，使用10%甲醛溶液将标本固定，石蜡包埋后待实施免疫组织化学染色。使用链霉素亲和生物素-过氧化酶免疫组化法(SP)切割组织标本，厚度3～4 μm，将切割好的标本放入温度为80℃烤箱中烤至30 min，脱水水化后，经柠檬酸高压蒸汽140℃缓冲液修复，经处理灭活内源性过氧化物酶；反复使用磷酸盐缓冲液进行冲洗至少3次，向内加入经1∶100稀释的浓缩型鼠抗人单克隆Ki-67，并置于4℃冰箱内；过夜使用磷酸盐缓冲液冲洗3次，加入试剂盒生物素相关二抗，再使用磷酸盐缓冲液冲洗3次。经二氨基联苯胺工作液温显色，使用显微镜观察，后利用苏木素复染，经1%盐酸乙醇分化5 s后使用流水冲洗约5 min；使用梯度乙醇脱水，利用松节油透明，采用中性树胶封片。以磷酸盐缓冲液代替一抗染色作为阴性对照物，使用美国Santa Cruz公司提供的对照物作为阳性对照。Ki-67染色若细胞膜或细胞质中出现棕黄色颗粒沉着则可判定为阳性细胞。上述操作中鼠抗人Ki-67单克隆抗体为克隆号MIB-1，检测全套超敏染色剂试剂盒与二氨基联苯胺显色剂均产自美国Maxim Biotech公司；显色剂、缓冲液、柠檬酸钠盐均由北京中杉金桥公司提供。三种蛋白染色方法基本一致。

1.3.3判别准则 经400倍显微镜可观察到切片的总体，判别阳性的规范均依据有无染色、染色程度及显色细胞数量联合进行：(+)：细胞显色百分比为1%～30%，呈淡黄色；()：细胞显色百分比为31%～60%，中等阳性反应，呈黄色；()：细胞显色百分比>60%，呈棕黄色。

1.3.4随访 随访形式为入院复查或门诊，随访内容包括影像学检查、体格检查等，除此外还应开展电话随访，全部患者中无失访者，最长随访时间为36个月。

1.4统计学方法 应用SPSS20.0统计学软件处理单因素采用Kaplan-Meier法检验，多因素采用Cox回归分析检验。

2 结 果

2.1治疗与随访 50例老年宫颈癌患者全部手术成功，术后9例(18.00%)患者接受放疗，7例(14.00%)患者术后接受化疗；对于存在切缘阳性、盆腔淋巴结阳性、宫旁组织阳性者，均于术后给予盆腔放疗与含顺铂的化疗。50例患者中有18例(36.00%)接受放化疗，化疗方案为：分3 d静滴的75 mg/m2顺铂联合4 d微量泵泵入的1g/(m2·24 h)5-氟尿嘧啶。全部患者接受36个月的随访，其中位随访时间为19.5个月。

2.2免疫组化结果 Ki-67蛋白强阳性表达占比最高，其次为中等阳性、弱阳性，p16蛋白经检测有23例呈阴性，其余阳性者以弱阳性表达为主，其次为中等阳性、强阳性；EGFR蛋白阴性表达5例，其余阳性者以强阳性表达为主，其次为弱阳性、中等阳性，见表1，图1～3。

表1 50例老年宫颈癌患者免疫组化结果〔n(%)〕

图1 Ki-67免疫组化染色不同表达情况(DAB,×400)

图2 p16在宫颈癌中阳性表达(DAB,×400)

图3 EGFR在宫颈癌中的阳性表达(DAB，×400)

2.3Ki-67、p16、EGFR表达与老年宫颈癌手术患者预后的相关性 经Kaplan-Meier单因素生存分析发现，Ki-67、p16、EGFR蛋白与老年宫颈癌手术患者预后相关，后经Cox比例风险函数检验发现，Ki-67、p16、EGFR蛋白阳性表达复发相对危险度是Ki-67、p16、EGFR阴性表达的4.474、3.055、2.958倍，提示Ki-67、p16、EGFR对老年宫颈癌手术患者无进展生存期有影响，可作为老年宫颈癌手术患者预后独立影响因素(P<0.05)。见图4～6，表2。

图4 老年宫颈癌术后患者Ki-67不同表达的生存曲线

图5 老年宫颈癌术后患者p16不同表达的生存曲线

图6 老年宫颈癌术后患者EGFR不同表达的生存曲线

表2 Ki-67、p16、EGFR阳性表达对老年宫颈癌预后影响Cox回归分析结果

3 讨 论

宫颈癌起病前期患者无明显症状，与慢性宫颈炎极为相似，部分患者可见子宫颈润滑，尤其是老年患者常伴子宫颈萎缩，以阴道出血、阴道分泌物增加、分泌物血腥或白色或黏稠、分泌物恶臭等为主要症状表现〔9〕。早期疾病得不到重视，错过最佳治疗机会将发展至进展期，进展期宫颈癌常有病变侵犯继发性症状，如便秘、肛门肿胀、闭塞、下肢疼痛、下肢肿胀等，更甚者可导致输尿管梗阻等并发症，危及生命〔10〕。

Ki-67蛋白是增殖细胞核抗原，该蛋白位于染色体10，包含2个变体，11.5与12.5 kb共同组成了该基因全长，在维持细胞增殖活性过程中有着关键作用〔11〕。在有丝分裂阶段S、G1、G2、M期Ki-67抗原将分解，因该抗原具有半衰期短的特点，其并不存在于G0期，故能够直接准确地反映出细胞增殖活性情况，且应用明显优于DNA指数、PCNA指数及DNA倍数等诸多其他可反映细胞增殖的指标〔12〕。一直以来，临床实际应用中，常以细胞核染色阳性对Ki-67进行判别，该蛋白检测后阳性表达越高，则提示恶性肿瘤患者分级程度越高，预后越差〔13〕。目前，Ki-67蛋白被广泛用于非肿瘤与肿瘤的细胞增殖活性评估中，且与卵巢癌、乳腺癌、脑胶质瘤等诸多肿瘤生物学行为息息相关，如当Ki-67蛋白表达<5%时，胃肠道间质瘤患者的PTEN基因点突变数可超过50%，患者死亡风险高〔14〕。本研究结果显示，50例老年宫颈癌手术患者Ki-67蛋白无阴性表达，且以强阳性表达占比最高，其次为中等阳性、弱阳性，经生存函数分析后发现，Ki-67蛋白高表达患者死亡风险高，预后差，该结果与多数研究基本一致〔15，16〕，提示Ki-67蛋白可用于老年宫颈癌手术患者预后的评估，其高表达可能是患者不良预后的独立影响因素。

p16基因被称为多肿瘤抑制基因INR4I、MTS1或CDRN2，其编码的p16蛋白是细胞周期素依赖性激酶阻止物，可以负调控Rb基因所控制的细胞增殖周期，普遍用于恶性肿瘤疗效评估与预后分析〔17〕。随着临床对宫颈癌研究的深入，相关研究指出宫颈癌患者HPV感染可能会增加患者p16表达〔18〕，杨然等〔19〕研究了宫颈癌手术治疗患者p16蛋白表达与术后生存期的关系发现，p16蛋白并不能作为患者独立的预后因素，且在生存分析中无意义；而本研究结果显示，经Kaplan-Meier单因素分析p16蛋白有统计学意义，与上述结果有差异，这可能是因为本研究中所选患者均为年龄≥60岁的老年患者，患者年龄大，身体素质差，预后不佳，故p16蛋白对其预后的预测更为敏感。但因本研究与其他类似研究还有一定差异，故尚不能将p16完全作为宫颈癌患者预后的独立因素，还应在后续的研究中进一步证实。

EGFR是一种原癌基因表达产物，参与肿瘤的发生发展过程，该蛋白在放疗抵抗的RTK-PI3K/AKt获得性途径中起到关键作用。EGFR的表达与诸多因素有关，Giordano等〔20〕研究表明，老年宫颈癌患者的EGFR阳性率(91%)是青年患者的1.18倍，而在本研究中，50例老年宫颈癌手术患者的EGFR阳性率为90%，与该报道结果基本一致，可见年龄对宫颈癌患者EGFR蛋白的影响。而研究了EGFR与患者预后的相关性后发现，随着时间的延长，EGFR阳性表达患者的生存优势不及阴性表达者，且经Kaplan-Merier生存曲线与Cox生存回归分析检查均有意义，表明EGFR蛋白与老年宫颈癌手术患者预后有一定相关性，随着该蛋白阳性表达增加，患者死亡风险提高，无进展期生存时间缩短。但因EGFR蛋白在宫颈癌患者中的表达仍存在一定阴性率，故尚不能将其作为患者独立的预后因素，仅能够认为其与患者预后相关。

综上所述，Ki-67、p16、EGFR蛋白表达均与老年宫颈癌手术患者预后有一定相关性，其中Ki-67、EGFR蛋白的高表达可能预示着高死亡风险，可作为预后独立因素，而p16蛋白因其阳性情况相对较弱，可能仅与预后相关，尚不能作为预后独立因素。