水飞蓟素通过调控TLR/NF-κB信号通路改善急性肺损伤大鼠肺功能作用研究*

张强泽 曹 斌 梁志勇

（山东省济南市人民医院，山东 济南 271100）

急性肺损伤（ALI）是指由于肺部感染、重症胰腺炎或脓毒症等因素导致肺组织细胞损伤，肺功能发生障碍的一种临床综合征，临床表现为严重性低氧血症和急性呼吸窘迫［1]。其中急性呼吸窘迫综合征是ALI的严重阶段，威胁患者生命安全。研究发现，感染等因素可导致炎性细胞在肺组织大量聚集，产生并分泌多种炎症因子，损伤肺组织细胞，参与急性肺损伤中的发生过程［2]。另外，由于气体交换受限，肺组织处于缺氧状态，细胞中氧化应激反应失控，也参与急性肺损伤病理过程［3]。水飞蓟素（Silymarin）提取自菊科植物水飞蓟的种子或果实，属于黄酮木脂素类化合物，因其具有抗氧化、清除毒素、促进蛋白质合成等功能，临床已被应用于治疗肝脏损伤，效果优良［4-5]，但是水飞蓟素对ALI的保护作用尚不清楚。本研究通过构建ALI大鼠模型，观察水飞蓟素对ALI大鼠肺功能的保护作用并初步研究其机制，旨在探讨将水飞蓟素用于治疗ALI的可能性。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康Wistar大鼠105只，清洁级，许可证号：SCXK（沪）-2016-00015，体质量 200～230 g，购于上海西普尔公司。所有大鼠集中进行常规饲养，本研究实验动物使用均遵守《实验动物管理条例》。

1.2 试药与仪器 1）试药：水飞蓟素片（规格：70 mg×20片，批号H20140470），购于德国MADAUS大药厂；地塞米松片（规格 0.75 mg×100片，批号 H14023304），购于山西同达药业公司；TLR4抑制剂TAK-242（纯度99.95%，货号HY-11109），购于美国 MCE公司；氯化钠注射液（规格为 0.9 g∶100 mL，批号 H32023396），购于辅仁药业公司；兔源Toll样受体4（TLR4）抗体、兔源核转录因子 （NF）-κB p65抗体、兔源GALIDH抗体、兔源Lamin B抗体，羊抗兔IgG二抗，购于美国ABCam公司；蛋白提取试剂盒（细胞质和细胞核）（货号C006225-0050）、DAB显色试剂盒（货号 A600885-0200），购于上海生工公司；单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）ELISA 试剂盒、 白细胞介素 （IL）-1β ELISA试剂盒、肿瘤坏死因子（TNF）-α ELISA试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、髓过氧化物酶（Myeloperoxidase，MPO）试剂盒，购于碧云天公司。 2）仪器：石蜡切片机（RM2025），购于德国Leica公司；自动血气分析仪（ABL 800 FLEX），购于美国 Radiometer公司。

1.3 分组与造模 将105只Wistar大鼠按照随机数字表法分为7组，每组15只，分别为：对照组、ALI组、地塞米松组和低、中、高剂量水飞蓟素组、TAK-242组。除对照组外，其余大鼠均采用尾静脉注射脂多糖（5 mg/kg）法建立 ALI模型［6]，出现轻微肺啰音者则为造模成功，对照组尾静脉注射等体积生理盐水。实验期间若大鼠出现意外死亡，则从备用大鼠中按上述方法建立ALI模型补足。

1.4 给药方法 造模成功后，立即给予各组大鼠相应药物。地塞米松、水飞蓟素给药溶液的制备：称取适量地塞米松片和水飞蓟素片，粉碎后分别加入0.9%氯化钠注射液中，制备成0.09 mg/mL地塞米松溶液和1.5、3.0、6.0 mg/mL水飞蓟素溶液，即配即用。大鼠用药浓度按照按体表面积法根据人类剂量分别计算得到。低、中、高剂量水飞蓟素组分别给予15、30、60 mg/kg水飞蓟素灌胃给药。地塞米松组给予0.9 mg/kg地塞米松灌胃给药。TAK-242组给予0.5 mg/kg TAK-242尾静脉注射给药。对照组和ALI组灌胃给予等量生理盐水，灌胃容积为10 mL/kg。给药3 d，每日1次。

1.5 标本采集与检测 给药24 h后，麻醉各组大鼠，暴露腹主动脉，采用血气针取血2 mL，然后处死各组大鼠，暴露胸腔，结扎右主支气管，经主气管将2 mL磷酸缓冲液注射入左侧肺泡，灌洗3次，收集肺泡灌洗液约5.6 mL，离心后保留上清待测，-20℃保存。取大鼠右侧肺脏下部组织，置于4%多聚甲醛中固定待用；另取右侧肺脏上中部组织，除去表面多杂质，称量并记录其湿重（W），置于60℃恒温箱中干燥。1）动脉血气分析：采用全自动血气分析仪检测各组大鼠动脉血中二氧化碳分压（PaCO2）和氧分压（PaO2）水平。 2）肺湿/干比（W/D）测定：右侧肺部上中部肺组织于恒温箱中干燥72 h后，称量并记录，计算肺W/D比重。3）肺组织病理形态变化检测：大鼠肺组织石蜡切片脱蜡、水化后，按照苏木精-伊红（HE）进行染色，中性胶封片，置于光学显微镜下，观察大鼠肺组织形态。4）肺泡灌洗液中SOD、MPO活性和炎症因子水平检测：分别采用SOD检测试剂盒、MPO检测试剂盒、MCP-1 ELISA试剂盒、IL-1β ELISA试剂盒、TNF-α ELISA试剂盒检测肺泡灌洗液中MCP-1、IL-1β和TNF-α含量。5）肺组织TLR4、NF-κB蛋白表达检测：研磨肺冷冻组织，采用试剂盒分别提取细胞质和细胞核总蛋白，BCA试剂盒测定肺组织中蛋白质总量。经SDS-凝胶电泳分离蛋白质，将蛋白质从SDS-凝胶转印至PVDF膜；采用5%脱脂奶粉常温封闭1 h；分别加入一抗兔源TLR4抗体、兔源NF-κB p65抗体、兔源GALIDH抗体、兔源Lamin B 抗体（1∶1 000）4 ℃孵育过夜；之后加入二抗羊抗兔IgG（1∶5 000）室温孵育1 h。经DAB显色试剂处理后采用Tanon软件拍摄蛋白条带图像并分析。

1.6 统计学处理 应用SPSS24.0统计软件。计量数据以（±s）表示，行单因素方差分析，两两比较行t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠 W/D、PaCO2、PaO2水平的比较 见表1。与对照组比较，ALI组大鼠W/D、PaCO2水平明显增高（P＜0.05），PaO2水平明显下降（P＜0.05）；与 ALI组比较，低、中、高剂量水飞蓟素组、地塞米松组和TAK-242组大鼠W/D、PaCO2水平均明显降低 （P＜0.05），PaO2水平明显增高（P＜0.05）。

表 1 各组大鼠 W/D、PaCO2、PaO2水平比较（±s）

表 1 各组大鼠 W/D、PaCO2、PaO2水平比较（±s）

与对照组比较，*P＜0.05；与 ALI组比较，△P＜0.05。 下同

组 别 n PaO2（mmHg）对照组 15 96.48±11.54 ALI组 15 49.34±8.21*地塞米松组 15 87.65±9.64*△7.13±1.21*△ 51.63±3.38*△中剂量水飞蓟素组 15 6.07±1.09*△ 47.16±3.25*△ 77.56±6.75*△高剂量水飞蓟素组 15 4.79±0.78*△ 40.58±2.74*△ 89.17±8.35*△TAK-242 组 15 4.91±0.83*△ 39.37±1.46△ 86.75±5.94*△W/D PaCO2（mmHg）4.35±0.85 38.17±3.76 8.42±1.65* 59.64±4.61*5.06±0.97*△ 39.18±3.26*△低剂量水飞蓟素组 15 61.33±5.78*△

2.2 各组大鼠肺组织结构变化比较 见图1。对照组大鼠肺泡明显，肺间质无水肿、未见炎性细胞和红细胞，肺组织结构正常；ALI组肺泡壁不规则，出现碎片填充、肺间质出现大量炎性细胞和红细胞渗透，肺组织呈现病理损伤；低、中、高剂量水飞蓟素组、地塞米松组和TAK-242组肺组织病变均不同程度减轻，其中高剂量水飞蓟素组、地塞米松组和TAK-242组大鼠的肺组织基本趋于正常。

图1 各组大鼠肺组织结构（HE染色，400倍）

2.3 各组大鼠SOD、MPO活性的比较 见表2。与对照组比较，ALI组大鼠肺泡灌洗液中SOD和MPO活性明显降低（P＜0.05）；与 ALI组比较，低、中、高剂量水飞蓟素组、地塞米松组和TAK-242组大鼠肺泡灌洗液中SOD和MPO活性明显增强（P＜0.05）。

表2 各组大鼠 SOD、MPO活性比较（U/mL，±s）

表2 各组大鼠 SOD、MPO活性比较（U/mL，±s）

组 别 n对照组 15 ALI组 15地塞米松组 15 SOD MPO 163.21±20.45 209.46±27.56 85.14±14.95* 97.25±16.42*162.68±21.13*△ 187.62±23.54*△低剂量水飞蓟素组 15 97.63±18.54*△ 109.34±19.21*△中剂量水飞蓟素组 15 123.34±18.37*△ 129.75±16.94*△高剂量水飞蓟素组 15 142.29±23.56*△ 168.34±25.64*△TAK-242 组 15 149.36±18.76*△ 163.72±21.73*△

2.4 各组大鼠肺泡灌洗液中炎症因子水平的比较见表3。与对照组比较，ALI组大鼠肺泡灌洗液中MCP-1、IL-1β 和 TNF-α 水平明显增高（P＜0.05）；与 ALI组比较，低、中、高剂量水飞蓟素组、地塞米松组和TAK-242组大鼠肺泡灌洗液中MCP-1、IL-1β和TNF-α水平明显降低（P＜0.05）。

表3 各组大鼠肺泡灌洗液中炎症因子水平比较（pg/mL，±s）

表3 各组大鼠肺泡灌洗液中炎症因子水平比较（pg/mL，±s）

组 别 n TNF-α对照组 15 231.23±22.49 ALI组 15 679.19±49.86*地塞米松组 15 283.74±19.98*△53.61±8.52*△ 391.57±31.62*△中剂量水飞蓟素组 15 36.78±6.26*△ 263.15±24.63*△ 418.43±42.38*△高剂量水飞蓟素组 15 25.73±4.31*△ 192.46±21.98*△ 273.29±29.78*△TAK-242 组 15 26.35±4.27*△ 175.67±17.52*△ 219.72±21.53*△MCP-1 IL-1β 14.53±3.32 134.26±19.43 68.47±12.11*449.57±49.31*24.83±4.13*△ 187.25±34.97*△低剂量水飞蓟素组 15 584.72±32.54*△

2.5 各组大鼠肺组织TLR4/NF-κB通路蛋白表达的比较 见图2，表4。与对照组比较，ALI组大鼠肺组织TLR4蛋白表达上调 （P＜0.05）、NF-κB蛋白核移位程度增加（P＜0.05）；与 ALI组比较，低、中、高剂量水飞蓟素组、地塞米松组和TAK-242组大鼠肺组织TLR4蛋白表达下调（P＜0.05）、NF-κB蛋白核移位程度降低。

图2 各组大鼠肺组织TLR4、NF-κB通路蛋白表达

3 讨 论

ALI是导致患者发生急性呼吸衰竭危急症的主要因素，严重者导致患者死亡。危重症患者易受到病原菌感染，由此引发的脓毒症等可进一步诱发ALI，脂多糖作为病原菌细胞壁的主要成分之一，可诱导急性肺损伤发生。本研究采用尾静脉注射脂多糖法构建ALI大鼠模型，结果发现脂多糖可导致大鼠出现低氧血症和肺水肿，造成肺组织病变，表明模型制备成功。肺脏是人体负责气血交换的重要器官，其功能障碍可累及其他脏器，对机体健康非常重要。据报道，采用具有抗氧化或抗炎活性的药物治疗可显著改善脓毒症等造成急性肺损伤，应用前景较好［6-7]。水飞蓟素是来自水飞蓟的醇提取物，具有清除氧自由基、促进细胞中蛋白质合成、促进细胞修复等功能［8]。Farjad等研究发现，水飞蓟素可显著改善镉处理所致小鼠的氧化应激损伤，增强小鼠对血清脂质过氧化清除能力和抗氧化防御能力［9]。本研究发现，水飞蓟素可明显降低W/D、PaCO2水平，提高PaO2水平，改善肺组织病变程度，提示水飞蓟素对ALI大鼠肺功能具有保护作用，但相关作用机制不清楚。

表4 各组大鼠肺组织TLR4、NF-κB通路蛋白表达比较（±s）

表4 各组大鼠肺组织TLR4、NF-κB通路蛋白表达比较（±s）

组 别 n TLR4/GAPDH对照组 15 0.41±0.11 ALI组 15 1.09±0.15*地塞米松组 15 0.51±0.09*△1.04±0.17*△ 0.94±0.13*△水飞蓟素中剂量组 15 0.62±0.11*△ 1.17±0.19*△ 1.06±0.09*△水飞蓟素高剂量组 15 0.29±0.06*△ 1.91±0.28*△ 0.65±0.13*△TAK-242 组 15 0.59±0.12*△ 1.28±0.16*△ 0.69±0.15*△核NF-κB/LaminB 质 NF-κB/GAPDH 0.71±0.15 1.95±0.37 2.28±0.43* 0.82±0.13*0.56±0.09*△ 1.21±0.25*△水飞蓟素低剂量组 15 1.13±0.14*△

氧自由基等活性氧含量增多所导致的肺组织细胞氧化损伤，在ALI损伤过程中发挥着重要作用［10]。活性氧是一类具有较强氧化活性、非常活泼的化学物质，一般情况下，机体中存在SOD和MPO等具有清除活性氧功能的酶，防止活性氧在机体内过量堆积，造成损伤［11]。当ALI发生时，由于肺组织处于损伤状态时，SOD和MPO等抗氧化酶活性受到抑制，清除氧自由基的能力降低，导致机体内累积过量氧自由基，进一步引起脂质、蛋白质等物质氧化，造成组织细胞损伤［12]。Ronchi等研究显示，吸入一氧化氮可明显提高ALI模型兔氧合能力，增强抗氧化能力，减轻氧化应激所致DNA损伤，改善肺损伤，保护肺功能［13]。另外，炎症反应在脓毒症等所致ALI疾病发展中也具有重要作用。Gerin研究表明，槲皮素可通过降低氧化应激反应和炎症因子水平，保护脓毒症所致大鼠肺损伤［14]。本研究发现，与对照组比较，ALI组大鼠肺组织SOD和MPO活性明显降低，MCP-1、IL-1β和 TNF-α水平明显增高；与ALI组比较，低、中、高剂量水飞蓟素组和TAK-242组肺组织SOD和MPO活性明显增高，MCP-1、IL-1β和TNF-α水平明显降低。表明水飞蓟素处理可增加ALI大鼠肺组织中SOD等抗氧化酶活性，降低肺组织中MCP-1等炎症因子水平，且与TLR4特异性抑制剂TAK-242作用一致，提示水飞蓟素抑制机体氧化应激损伤和炎症反应的作用可能与TLR4通路有关。

研究表明，氧化应激反应和炎症反应的发生与TLR4/NF-κB通路过度激活有关［15]。在哺乳动物细胞中，Toll样受体同时作为先天性免疫受体和模式识别受体，参与先天性免疫反应和获得性免疫反应，分布于白细胞、树突状细胞等表面，参与识别多种病原物，启动免疫反应［16]。一些Toll样受体如TLR4，与炎症信号通路的激活密切相关，参与多种疾病发生和发展［17]。当受到外界病原物刺激，细胞中TLR4表达增加，激活下游炎症因子如TNF-α转录，之后TNF-α可促进细胞质中NF-κB进入细胞核而活化，活化后的NF-κB可进一步激活 IL-1β、MCP-1 等炎症相关因子表达［18]。Chi等发现，右美托咪定可能通过抑制TLR4/NF-κB激活，抑制炎症反应，改善原位自体肝移植所致大鼠急性肺损伤［19]。Jiang Q等研究显示，白藜芦醇苷可通过下调TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达，降低IL-6等炎症因子水平，改善脂多糖诱导的大鼠急性肺损伤［20]。本研究发现，脂多糖引起大鼠急性肺损伤过程中，肺组织TLR4蛋白表达上调、NF-κB核移位增加；与ALI组比较，低、中、高剂量水飞蓟素组和TAK-242组大鼠肺组织TLR4蛋白表达下调、NF-κB核移位降低，表明水飞蓟素可抑制TLR4表达和NF-κB核移位，与TAK-242作用一致，提示水飞蓟素可能通过抑制TLR4/NF-κB通路激活发挥对ALI大鼠肺功能的保护作用。

综上所述，水飞蓟素可能通过抑制TLR4/NF-κB通路激活，减轻氧化应激和炎症反应，进而改善急性肺损伤大鼠肺功能。