糖维胶囊对2型糖尿病大鼠视网膜缺氧诱导因子-1α和核因子-κB水平的影响

崔 杰

糖尿病视网膜病变(Diabetic Retinopathy，DR)是糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)的严重微血管并发症，也是造成患者失明的主要原因[1]。早期DR的特征是血管神经炎症、细胞凋亡和血-视网膜屏障(BRB)的破坏。虽然DM患者的临床评估和视网膜解剖提供了关于DR的特征和进展的信息，但是该疾病的潜在病理生理机制尚未被阐明。缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)为一种重要的内源性信号蛋白，研究表明，由缺血缺氧引起HIF-1α升高会导致血管新生[2]。核因子-κB(NF-κB)在DM并发症中发挥重要作用，它可调节参与炎症反应众多基因的转录[3]。目前对于DR的治疗主要为控制血糖，糖维胶囊是一种以格列本脲为主，其它中药为辅的中西药结合控制血糖的药物。本文旨在探讨糖维胶囊对糖尿病视网膜病变的作用，为该药的应用提供基础实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂和仪器

1.1.1动物和分组：选择6-7周龄，体重200-250g的雄性SPF级SD大鼠45只(购自凯学生物技术有限公司，SCXK(沪)2016-36)。每笼两只，置于室温20-25℃，湿度50%± 5%和12 h光照/黑暗循环环境中，提供充足食物和水。将45只大鼠随机分为对照组(NC组，n=10)和2型DM模型组(模型组，n=45)，适应性喂养1周后造模。

1.1.2主要试剂：糖维胶囊(成份：黄芪、黄精、天花粉、葛根、黄连、丹参、格列本脲；石药集团河北唐威药业有限公司，批号：20151126，规格：0.5g/囊)；格列本脲片(天津药物研究院药业有限公司，批号：20151023，规格：2.5mg/片)；链脲佐菌素(STZ，S0130; Sigma-Aldrich)；柠檬酸钠、柠檬酸(大自然生物集团)；抗HIF-1α抗体(3716s，CST)；抗NF-κB抗体(8242s，CST)；抗β-actin抗体(sc-130656，Santa Cruz)。

1.1.3主要仪器：蔡司显微镜(Axio Lab.A1，zeiss)； Real-Time PCR检测系统(Bio-Rad CFX96)，低温高速离心机(湖南湘仪)；Western blot全能转印系统(Bio-Rad)；天平(FA2004B，上海平轩科学仪器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1大鼠2型DM模型制备：模型组大鼠用高脂高糖(大鼠基础饲料68%，蔗糖10%、蛋黄粉10%、猪油10%、胆固醇1.8%、胆盐0.2%)喂养8周，通过单次腹腔注射STZ(55mg/kg，采用0.1mol/L和pH4.4-4.5柠檬酸缓冲液制备)复制2型DM模型[4]。对照组大鼠腹腔注射等量柠檬酸缓冲液(无菌pH4.4-4.5)。72h后，空腹血糖水平> 16.7mmol/L即造模成功，2只在造模过程死亡，3只造模失败，成模30只。

1.2.2成模大鼠分组与处理：将成模后大鼠随机分为三个亚组：DM组、格列本脲治疗组(DM+G组)、糖维胶囊治疗组(DM+T组)。造模成功后，DM+G组大鼠给予20mg/kg/天格列本脲灌胃，DM+T组给予150mg/kg/天糖维胶囊灌胃，DM组和NC组给予等量生理盐水灌胃。连续灌胃4周。

1.2.3视网膜标本采集与处理：大鼠灌胃4周后腹腔注射麻醉，手术摘除大鼠眼球后迅速置于-80℃冰箱，实验前取出在高压无菌环境中剥离大鼠视网膜。将视网膜组织常规石蜡包埋切片(4μm)。脱蜡脱水，常规HE染色，光学显微镜下观察视网膜病理变化。

1.2.4RT-PCR检测NF-κB、HIF-1α mRNA表达量：使用TRIzol(目录号15596； Thermo Fisher Scientific，Inc.，Waltham，MA，USA)法提取视网膜(每组取3只大鼠)总RNA，测定浓度和纯度后使用TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix(目录号AT301; TransGen Biotech Co.，Ltd.，Beijing，China)将RNA逆转录成cDNA。使用TransStart Top Green qPCR SuperMix(目录号AQ131; TransGen Biotech Co.Ltd)通过RT-qPCR检测NF-κB和HIF-1α mRNA相对表达水平，以β-actin为内参照。使用Primer Express软件2.0版系统(Applied Biosystems; Foster City，CA，USA)设计引物。引物序列如下：β-actin，正向5'-AGC CAT GTA CGT AGC CAT CC-3'，反向5'-ACC CTC ATA GAT GGG CAC AG-3'；NF-κB，正向5'-TGA GGC TGT TTG GTT TGA GA-3'，反向5'-TTA TGG CTG AGG TCT GGT CTG-3'；HIF-1α，正向5'-ACA AGT CAC CAC AGG ACA G-3'，反向5'-AGG GAG AAA ATC AAG TCG-3'。使用以下循环方案进行PCR反应：95℃ 5min预变性，95℃ 5s，58℃ 15s和72℃ 20s，45个循环。扩增后运行解离曲线以鉴定特定的PCR产物。所有程序均按照制造商的协议进行。使用2-ΔΔCt法计算mRNA的相对表达水平。

1.2.5Western blotting法检测NF-κB、HIF-1α蛋白水平：采用蛋白提取试剂盒(北京中山金桥生物技术; OriGene Technologies，Inc.，Rockville，MD，USA)提取视网膜蛋白质，Bradford蛋白质测定法测定蛋白浓度。操作步骤为：通过8%-12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离等量蛋白质(800μmol/L)并电转到聚偏二氟乙烯膜(EMD Millipore，Billerica，MA，USA)上。将膜在5%脱脂奶中室温封闭2h，并与抗HIF-1α抗体(多克隆兔抗大鼠； 1∶1 000)，抗NF-κB抗体(多克隆兔抗鼠； 1∶1 000)4℃过夜。将膜在0.1%TBS-Tween-20中洗涤，并在室温下与抗兔IgG二抗(目录号ZDR-5306；1∶5 000，北京中山金桥生物技术)共孵育1h。最后用ChemiDoc TM MP系统(Bio-Rad Laboratories)对印迹进行扫描，并使用ImageJ 1.51软件(National Institutes of Health，Bethesda，MA，USA)对条带进行定量分析。以β-actin为内参照，采用目标蛋白与β-actin蛋白条带灰度比值代表该蛋白的相对表达量。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 各组大鼠视网膜病理改变

光镜下观察NC组、DM组、DM+G组及DM+T组视网膜变化。NC组大鼠视网膜的所有细胞层清晰整齐地排列，视网膜呈现疏松水肿。DM组，视网膜水肿，视网膜神经纤维层出现核固缩，内核层排列紊乱，DM+G组大鼠视网膜神经纤维层病变减轻，DM+T组大鼠，视网膜水肿显著减弱，神经节层整齐排列。详见图1。

图1 不同组别大鼠视网膜病理改变情况(HE，×200)

2.2 各组大鼠NF-κB、HIF-1α mRNA表达量

各组大鼠NF-κB mRNA表达水平差异有统计学意义(F=24.852，P<0.05)。与NC组比较，DM组NF-κB mRNA表达水平明显上调，差异有统计学意义(q=11.457，P<0.05)，与DM组比较，DM+G组和DM+T组NF-κB mRNA表达水平均下降(q=5.697、9.165，P均<0.05)，且DM+T组下降更明显，差异有统计学意义(q=3.468，P<0.05)。各组大鼠视网膜组织HIF-1α mRNA表达水平差异有统计学意义(F=6.451，P<0.05)。与NC组比较，DM组大鼠HIF-1α mRNA表达水平明显上升(q=5.297，P<0.05)，与DM组比较，DM+G组HIF-1α mRNA表达水平差异无统计学意义(q=1.676，P>0.05)，DM+T组则明显下降(q=4.827，P<0.05)。

表1 各组大鼠NF-κB、HIF-1α mRNA相对表达量

注：与NC组比较，1)P<0.05；与DM组比较，2)P<0.05；与DM+G组比较，3)P<0.05

2.3 各组大鼠NF-κB、HIF-1α蛋白表达量

各组大鼠NF-κB 蛋白表达水平比较差异有统计学意义(F=54.782，P<0.05)。与NC组比较，DM组NF-κB蛋白表达水平明显上调，差异有统计学意义(q=15.614，P<0.05)，与DM组比较，DM+G组和DM+T组NF-κB蛋白表达水平均下降(q=4.229、13.337，P<0.05)，且DM+T组下降更明显，差异有统计学意义(q=9.108，P<0.05)。各组大鼠视网膜组织HIF-1α 蛋白表达水平差异有统计学意义(F=22.431，P<0.05)。与NC组比较，DM组大鼠HIF-1α 蛋白表达水平明显上升(q=11.060，P<0.05)，与DM组比较，DM+G组和DM+T组HIF-1α 蛋白表达水平明显下降，差异有统计学意义(q=5.530、8.391，P>0.05)。

表2 各组大鼠NF-κB、HIF-1α蛋白相对表达量

注：与NC组比较，1)P<0.05；与DM组比较，2)P<0.05；与DM+G组比较，3)P<0.05

3 讨 论

DR是一种以细胞凋亡和神经炎症为特征的血管性神经炎症疾病，为DM致盲的主要原因，也是DM最常见的并发症之一[5]。DR的发病机制未阐明，认为是多种因素作用的结果。DR在DM实验模型中的早期征兆是缺氧应激引起的血管炎症，促炎细胞因子和炎性介质已被报道可促进血管通透性增加、白细胞黏附和视网膜细胞死亡[6]。

研究显示，视网膜NF-κB在DM早期被激活，并保持激活达14个月[7]。糖尿病视网膜内皮细胞核中NF-κB的p50亚基积聚增加，提示NF-κB在DM患者的视网膜血管系统中也明显被激活。本研究表明，在高血糖环境中，视网膜内皮细胞NF-κB表达增加，这与上述研究结果一致。HIF是一种异二聚体转录因子，在低氧条件下被激活和稳定，并促进血管生成因子如血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子(TGF-3)，红细胞生成因子如红细胞生成素(EPO)细胞存活和增殖因子如 (IGF-2)、分化抑制因子2(ID2)、一氧化氮合酶(NOS)等生成增加[8]。HIF-1α是一个氧敏感的亚基，在低氧条件下表达，据报道阻断或沉默HIF-1α调节的VEGF通路对DM有潜在益处[9]。在本研究中，DM大鼠视网膜NF-κB和HIF-1α表达增多。NF-κB和HIF-1α均是炎症相关因子，在高血糖诱导的低氧环境中，二者均会导致血管新生。本研究中，DM+G组大鼠视网膜神经纤维层病变减轻，且NF-κB、HIF-1α mRNA及蛋白表达水平均下降，从一定程度上减轻了视网膜损伤的严重程度，但疗效不如DM+ T组。这可能与糖维胶囊在控制血糖治疗的同时通过黄芪[10]益气养精、丹参活血通络等的作用，协同降低血糖，通畅脉络，降低因高血糖引起的缺氧压力有关。本文DM+T组大鼠NF-κB及HIF-1α表达水平较DM+G组下降明显，也从分子层面阐释了糖维胶囊在降低血糖及减轻低氧压力中的作用较格列本脲作用显著。结合本文结果推测糖维胶囊的治疗作用主要体现在其有效控制血糖的能力，但其是否直接作用于NF-κB及HIF-1α有待进一步深入研究。

综上所述，糖维胶囊因其中西药结合相互作用的结果，能够有效降低DM大鼠视网膜NF-κB及HIF-1α表达水平，对控制血糖、减轻视网膜缺氧压力有显著作用。