酶法辅助提取鱼腥草挥发性成分的研究及GC-MS分析*

张道英, 程庚金生, 李 瞻, 刘晓侠, 黄 浩

(赣南医学院药学院, 江西 赣州 341000)

鱼腥草为《中国药典》(2015年版一部)收录的中草药，又名蕺菜、侧耳根、紫背鱼腥草等，为三白草科蕺菜的新鲜全草或地上干燥部分[1]，具有清热解毒、消肿排脓、利尿通淋的作用，主要分布于陕西、四川、甘肃及长江流域以南各地。新鲜鱼腥草上表面呈绿色，背面常呈紫红色，叶片呈心形，具有浓郁的腥臭味；干鱼腥草呈黄绿色或灰棕色，叶片卷折皱缩，展平后呈心形，具有鱼腥味。鱼腥草中挥发油成分的药用活性最高，药理作用为抗菌、抗炎、抗病毒、利尿等，其挥发油主要成分为：癸酰乙醛(又名“鱼腥草素”)、甲基正壬酮、乙酸龙脑酯、月桂烯、癸酸、癸醛等[2]。在古代，鱼腥草就开始被人们作为野菜食用，其抗菌利尿的作用慢慢被人们所熟知，食用范围也越来越广，可生食可熟食，也可以煎煮、泡水，直接饮服。在医学上，鱼腥草常被提取浓缩制成药物，但是由于鱼腥草中的挥发油成份容易聚合、挥发，其性质很不稳定。挥发油一类在常温下能挥发的、可随水蒸气蒸馏的、与水不相混的油状液体，常用的提取方法有水蒸气蒸馏法、溶剂萃取法和超临界流体萃取法等[2]。随着中草药化学成分提取技术的不断发展和提高，人们发现可利用纤维素酶破坏植物细胞壁结构，使鱼腥草中挥发油更大程度地溶出，从而提高有效成分的提取率和稳定性[3]。本文采用纤维素酶分别辅助提取鱼腥草干品和鲜品的挥发油，并用GC-MS法进行分析，同时和未加酶直接提取得到的鱼腥草鲜品和干品中的挥发性成分进行比较。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验仪器BP-Ⅱ型托盘天平(上海光正医疗仪器有限公司)，FA1104型电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)，HH-S24s型数显恒温水浴锅(金坛市大地自动化仪器厂)，DZTW型调温电热套(北京市永光明医疗仪器有限公司)，蒸馏装置(圆底烧瓶1 000 mL、挥发油提取器、冷凝管)，气相色谱-质谱联用仪(GC-MS-TQ8040，岛津企业管理有限公司)。

1.1.2实验试剂无水乙醚(分析纯，江苏强盛功能化学股份有限公司)，无水硫酸钠(分析纯，天津市恒兴化学试剂制造有限公司)，纤维素酶(≥15 U·mg-1，天津市光复精细化工研究所)，一水合柠檬酸(分析纯，江苏强盛功能化学股份有限公司)，氢氧化钠(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)。

1.1.3实验材料新鲜鱼腥草(采于陕西省汉中市自然环境下生长的鱼腥草)，干品鱼腥草(购于赣州市康佰大药房，产地为湖北)，新鲜鱼腥草和干品鱼腥草均经赣南医学院药学院生药教研室胡海波老师鉴定，为三白草科植物鱼腥草正品。

1.2方法

1.2.1干品挥发油提取

1.2.1.1最佳提取条件根据何刚等[4]报道的鱼腥草药材中挥发油的最佳提取工艺，将鱼腥草干品剪碎至1 cm小段，加水浸泡30 min，水蒸气蒸馏法提取挥发油5 h。

1.2.1.2提取方法去除鱼腥草干品中的杂质，准确称取50 g样品，剪碎至1 cm左右的小段，放入圆底烧瓶中，加入600 mL蒸馏水，浸泡30 min，用水蒸气蒸馏法微沸提取约5 h，至挥发油的量不再增加，冷却1 h，用无水乙醚萃取，加无水硫酸钠脱水干燥，密封、避光、冷藏保存。

1.2.2干品加酶挥发油提取

1.2.2.1最佳提取条件根据文献报道[4-5]将样品剪碎至1 cm小段，加水浸泡30 min，按加酶量1%(与样品的质量百分比)、酶解温度40 ℃、酶解pH 4.5、酶解时间1 h的条件先行酶解，然后用水蒸气蒸馏法提取5 h。

1.2.2.2提取方法去除干品杂质，准确称取50 g样品，剪碎至1 cm左右的小段放入圆底烧瓶中，加入600 mL蒸馏水，浸泡30 min，加入纤维素酶0.5 g，调pH至4.5，40 ℃水浴酶解1 h，然后用水蒸气蒸馏法微沸提取约5 h，至挥发油的量不再增加，冷却1 h，用无水乙醚萃取，加无水硫酸钠脱水干燥，密封、避光、冷藏保存。

1.2.3鲜品挥发油提取

1.2.3.1最佳提取条件根据文献报道[3]，将鱼腥草鲜品剪碎至1 cm小段，浸泡30 min，提取5 h。

1.2.3.2提取方法经实验研究，将鱼腥草鲜品去除杂质、洗干净后阴干，准确称取样品150 g，剪碎至1 cm左右的小段放入圆底烧瓶中，加入650 mL蒸馏水，浸泡30 min，提取方法同干品。

1.2.4鲜品加酶挥发油提取

1.2.4.1最佳提取条件根据文献报道[3]，将样品剪碎至1 cm小段，加水浸泡30 min，按加酶量0.6%(与样品的质量百分比)、酶解温度40 ℃、酶解pH 6.0、酶解时间2 h的条件先行酶解，然后用水蒸气蒸馏法提取5 h。

1.2.4.2提取方法经实验研究，将鱼腥草鲜品去除杂质、洗干净后阴干，准确称取样品150 g，剪碎至1 cm左右的小段放入圆底烧瓶中，加入650 mL蒸馏水，浸泡30 min，加入纤维素酶0.9 g，调pH至6.0，40 ℃水浴酶解2 h，然后用水蒸气蒸馏法微沸提取约5 h，至挥发油的量不再增加，冷却1 h，用无水乙醚萃取，加无水硫酸钠脱水干燥，密封、避光、冷藏保存。

1.2.5GC-MS含量测定

1.2.5.1进样准备将提取好的挥发油样品分别用无水乙醚稀释20倍(即取挥发油50 μL，无水乙醚950 μL)，待进样分析。

1.2.5.2GC-MS分析条件[4]气相色谱条件：色谱柱为石英毛细管柱(29 m×25 m×0.25 μm)；检测器为FID检测器，检测器温度为260 ℃；进样口温度为250 ℃；载气为高纯He气(99.999%)；流速为1.0 mL·min-1；分流比为10∶1；进样量为1 μL。

程序升温条件：起始温度为70 ℃，保持3 min，以5 ℃·min-1升温至140 ℃，保持3 min，再以10 ℃·min-1升温至250 ℃，保持10 min。

质谱条件：电子能量为70 eV，离子源温度为230 ℃[5]。

2 结 果

2.1实验结果在上述实验条件中，通过GC-MS分析得到鱼腥草挥发性化学成分的总离子电流图，结果见图1、2、3、4，通过NIST11和NIST11s数据库自动检索，根据检索结果中相似度较高的几个成分并结合参考文献[6-7]，最终确定挥发油中各化学成分，结果见表1和表2。

图1 鱼腥草干品挥发性化学成分总离子流图

图2鱼腥草干品加酶挥发性化学成分总离子流图

图3 鱼腥草鲜品挥发性化学成分总离子流图

图4 鱼腥草鲜品加酶挥发性化学成分总离子流图

表1 鱼腥草干品和干品加酶挥发性化学成分分析结果

续表1 鱼腥草干品和干品加酶挥发性化学成分分析结果

表2 鱼腥草鲜品和鲜品加酶挥发油化学成分分析结果

2.2结果分析根据图1～4和表1、表2分析可知，鱼腥草干品中挥发性成分占总峰面积的90.68%，共检测到39种组分，其中24种化学成分可鉴别为挥发性成分；干品加纤维素酶提取得到的挥发性成分占总峰面积的97.47%，共检测到74种组分，其中36种化学成分可鉴别为挥发性成分；鱼腥草干品和干品加纤维素酶得到的挥发性成分有10种成分是相同的。鱼腥草鲜品挥发性成分占总峰面积的97.15%，共检测到56种组分，其中30种化学成分可鉴别为挥发性成分；鲜品加纤维素酶提取得到的挥发性成分占总峰面积的98.79%，共检测到37种组分，其中19种化学成分可鉴别为挥发性成分；鱼腥草鲜品和鲜品加纤维素酶得到的挥发性成分有13种成分是相同的。

鱼腥草干品中挥发性成分含量较高的成分为：甲基正壬酮C11H22O(46.89%)、α-蒎烯C10H16(9.37%)、β-月桂烯C10H16(7.4%)、庚醇C7H16O(5.7%)；干品加酶提取得到的挥发性成分中含量较高的成分为：甲基正壬酮C11H22O(38.11%)、β-月桂烯C10H16(8.47%)、庚醇C7H16O(6.1%)、癸酸C10H20O2(5.6%)；鱼腥草鲜品挥发性成分中含量较高的成分为：β-月桂烯C10H16(36.6%)、甲基正壬酮C11H22O(26.88%)、β-罗勒烯C10H16(5.05%)；鲜品加酶提取得到的挥发性成分中含量较高的成分：甲基正壬酮C11H22O(40.48%)、β-月桂烯C10H16(40.15%)。除了萜类化合物、酮类化合物、脂类化合物这些主要成分，还有一些其他成分，如烃、醇、酸、醛类化合物等。根据文献报道[8]，用水蒸气蒸馏法鉴定出的鱼腥草挥发油的主要成分有：甲基正壬酮、β-月桂烯、癸酸、4-松油醇和乙酸龙脑酯等，和本实验鉴定出的主要成分相似。

3 讨 论

根据结果分析可知，鱼腥草挥发油成分相对含量大小顺序为：鲜品加酶>鲜品，干品加酶>干品，鲜品>干品，可以得出在提取挥发油时，加入适量的酶可以使挥发油的含量有所增加，说明加酶有助于挥发油的提取，可以优化挥发油的提取工艺。鲜品挥发油的相对含量也高于干品，这可能是由于干品在干燥的过程中受温度、湿度、阳光照射等环境因素影响，导致部分挥发油挥发，造成含量减少。从表1和表2可以看出鱼腥草干品加酶后成分种类增加，但主要成分基本相似，而鲜品加酶后成分种类减少，主要成分相似，但主要成分的含量增加。从各个挥发油样品的种类来看，其主要成分基本相同，只是相对含量上存在一定的差异，而其他成分存在差异较大。

鱼腥草挥发油主要成分为癸酰乙醛(又名鱼腥草素)，是鱼腥草的主要杀菌成分。而在本文中未检测到该成分，根据文献报道[9-10]，可能是因为癸酰乙醛不稳定，在水蒸气蒸馏过程中易受热氧化为癸酰乙酸，而癸酰乙酸又极易脱酸降解为甲基正壬酮，而本文中各挥发油成分中甲基正壬酮含量都较高，可能包含了降解产物，但是由于甲基正壬酮也是鱼腥草挥发油的主要成分之一，所以是否包含降解产物，有待进一步验证，也有可能是受产地、气候、操作方法、存储方法等因素的影响[11-12]。