水环境对地衣芽孢杆菌生长的影响

陶瑞东，王 鑫，高欣仪，周 银，张 剑

（武汉轻工大学化学与环境工程学院，湖北武汉430023）

地衣芽孢杆菌是一种土壤中常见的革兰氏阳性嗜热菌，能分泌多种酶系，如耐高温的碱性蛋白酶[1]、纤维素酶和半纤维素酶[2]等。该菌在废水蛋白质降解[3]、洗涤剂工业[4]、饲料添加剂[5]等领域得到了广泛应用。与其他生物（如藻类、硝化细菌等）一样，能有效降解水体中的N（以NH4+和NO2-为主）和P[6]，以减轻水体富营养化程度。由于地衣芽孢杆菌在生长繁殖过程中要消耗大量氧气，故能起到有效地抑制其他杂菌繁殖[2]，进而提高水产养殖业的经济效益。

本文研究了水环境对地衣芽孢杆菌生长繁殖的影响，探讨了水体中的NO3--N 浓度对地衣芽孢杆菌利用葡萄糖能力的影响。通过优化水环境的条件，找到了地衣芽孢杆菌的适宜生长条件，这些工作对合理利用地衣芽孢杆菌有一定的借鉴和参考意义。

1 实验部分

1.1 材料

菌种：地衣芽孢杆菌，购于落星生物工作室。

试剂：磷酸二氢钾、葡萄糖、硝酸钾等；其他试剂均为市售分析纯。

仪器：UV-2102C 型紫外可见分光光度计（UNICO（上海）仪器有限公司）；HH-2 数显恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）；80-2 电动离心机（江苏金坛医疗仪器厂）；pHS-3C 酸度计（上海仪电科学仪器股份有限公司）。

1.2 方法

葡萄糖含量的测定：按DNS 试剂法[7]。标准曲线方程：Y=1.178 X（mg）-0.038 4，R2=0.991 7。

HPO42-含量测定：按磷钼蓝分光光度法（GB/T 5750.5-2006）测定。具体操作如下：取菌水解液，于4 000 rpm离心10 min。取上清液0.1 mL，用蒸馏水稀释至50 mL，加入4 mL 钼酸铵—硫酸溶液后，再滴加一滴饱和的氯化亚锡溶液，显色10 min,于650 nm 处测量吸光度。测定HPO42-的标准曲线方程：Y=0.002 1 X（μg）-0.004 3，R2=0.993 4。

2 结果与分析

2.1 温度对地衣芽孢杆菌利用葡萄糖的影响

保持培养条件（pH 为6.5；葡糖糖、HPO42-、NO3-N浓度分别为3.6 mg/mL、0.98 mg/mL、0.62 mg/mL；0.4 g/L地衣芽孢杆菌接种量）不变，测试温度对地衣芽孢杆菌利用葡萄糖的影响（见图1）。研究表明，当水环境中无时，地衣芽孢杆菌对葡萄糖的利用能力有限，生长速率缓慢。不过，其活性仍与温度有关，其强弱顺序依次为37℃＞26℃＞45℃。当存在氮源时，地衣芽孢杆菌利用葡萄糖的能力明显增强。在试验温度范围内，地衣芽孢杆菌对葡萄糖利用能力的强弱顺序是：37℃≥45℃＞26℃。地衣芽孢杆菌在26℃时利用葡萄糖的能力弱，归因于培养温度低，导致生长、繁殖速度过缓。然而，当培养温度升至45℃，地衣芽孢杆菌利用葡萄糖的能力依然十分强劲，可以与37℃媲美。可见，氮源的存在，对维持地衣芽孢杆菌的热稳定性具有积极的作用。

2.2 NO3--N 浓度对地衣芽孢杆菌利用葡萄糖的影响

图1 温度对地衣芽孢杆菌利用葡萄糖的影响

图2 NO3- 对地衣芽孢杆菌利用葡萄糖的影响

为了进一步考查NO3--N 浓度对地衣芽孢杆菌利用葡萄糖的影响，保持水环境酸度（pH=6.5）、P 含量（0.98 mg/mL）不变，提高了水环境葡萄糖浓度（7.2 mg/mL）、降低了地衣芽孢杆菌的接种量（0.1 g/L），在37℃的培养条件下测试了NO3--N 浓度对地衣芽孢杆菌利用葡萄糖的影响（见图2）。研究表明，在0～20 h 的培养时间内，NO3--N 浓度几乎不影响地衣芽孢杆菌对葡萄糖的利用。当培养时间超过20 h 时，水环境中的NO3--N 明显影响地衣芽孢杆菌对葡萄糖的利用。当NO3--N 浓度在0～46.7 mg/L 时，随着NO3--N 浓度增大，地衣芽孢杆菌对葡萄糖的利用能力则增强；当NO3--N 浓度≥46.7 mg/L，随着NO3--N 浓度的增大，地衣芽孢杆菌利用葡萄糖的能力减弱。可见，地衣芽孢杆菌对葡萄糖利用能力大小与水环境中的NO3--N 浓度有关。46.7 mg/L 的NO3--N 浓度对地衣芽孢杆菌利用葡萄糖最有利。

2.3 酸度的影响

2.3.1 酸度对地衣芽孢杆菌利用葡萄糖的影响

在37℃，葡糖糖、HPO42-、NO3--N 初始浓度分别为3.6 mg/mL、0.98 mg/mL、23.4 mg/L，活性干地衣芽孢杆菌干粉接种量为0.4 g/L 的培养条件下，研究了酸度对地衣芽孢杆菌利用葡萄糖的影响（见图3）。研究表明，在1天的培养时间内，地衣芽孢杆菌利用葡萄糖的能力均较弱；培养时间达到48 h 后，在pH=5.0 和pH=9.0 的初始酸度培养环境下，地衣芽孢杆菌对葡萄糖的消耗率达95%，要获得如此高的消耗率，pH=8.0 的培养条件需要3 天时间，pH=6.0 和pH=7.0 的培养环境需要更长的时间。由此可见，水环境酸度对地衣芽孢杆菌利用葡萄糖的能力影响较大。在pH=5.0（pH=9.0）时最强，其次是pH=8.0，pH=7.0 和pH=6.0 的水环境利用葡萄糖能力相对较弱。

图3 酸度对地衣芽孢杆菌利用葡萄糖的影响

图4 酸度对地衣芽孢杆菌利用P 的影响

2.3.2 不同酸度对地衣芽孢杆菌利用P 的影响

在图3 的培养条件下，研究了酸度对地衣芽孢杆菌利用P 的影响（见图4）。研究表明，经过6 天的培养，水环境中磷的变化经历了先增高后下降两个阶段。第一阶段，经过2 天的培养，pH=5.0 的初始培养液中的磷含量升至最大值，而其他酸度培养条件需3 天，这一阶段是地衣芽孢杆菌进入新环境的适应期和对数生长期。微生物进入新环境，不适应水体新环境的微生物自然死亡，释放出磷，导致水体磷含量升高；第二阶段，是地衣芽孢杆菌生长繁殖的稳定期。随着培养时间的延长，水体中的磷缓慢下降。磷是构成细胞体的核酸、磷脂和辅酶的重要组成成分，水体中磷的降低，正是地衣芽孢杆菌用于生长繁殖的结果。不过，菌体对磷的需求量并不是很大，导致地衣芽孢杆菌对磷的利用速率缓慢。

2.3.3 酸度对生物量的影响

在与图3、图4 相同的培养条件下，地衣芽孢杆菌在水体中的生长经历了适应期、生长对数期、稳定期、衰亡期四个阶段。不过，水环境酸度不同，各阶段到来的时间有别。例如，在pH=6.0 的水体环境中，达到对数期需要1 天时间；在pH=8.0 的环境，达到对数期需要48 h；pH=7.0 的水体环境，呈现对数期特征所需时间更长。在某些培养环境中，适应期、对数期和稳定期的特征并不明显，如在pH=5.0 培养时，第1 天呈现明显的对数期特征，即微生物增长速率呈线性递增，经过2 天培养时，生物量仍持续增大。

图5 培养时间与地衣芽孢杆菌生物量的关系

结合图5，综合考查地衣芽孢杆菌利用葡萄糖、P 的结果。接种的前2 天，地衣芽孢杆菌处于适应期和对数期。葡萄糖维持一天的稳定后快速下降，生物量增至最大。在对数期，菌体快速增殖，由于受水环境养分限制，部分菌体呈现死亡体征，伴随P 的释放，导致水环境P浓度增大。经过3～5 天培养，地衣芽孢杆菌生物量进入稳定期，由于受碳源（葡萄糖）的影响，生物量呈波动变化，水环境中的P 浓度下降正是菌体利用P 的结果。培养时间进入第6 天，生物量出现衰亡期迹象，菌体总数开始回落。

3 结论

（1）地衣芽孢杆菌利用碳源（葡萄糖）的最适温度为37℃。

（2）水环境NO3--N 浓度影响地衣芽孢杆菌利用葡萄糖的能力。无NO3--N 时，地衣芽孢杆菌利用葡萄糖的能力弱，46.7 mg/L NO3--N 浓度最利于地衣芽孢杆菌降解葡萄糖。

（3）地衣芽孢杆菌利用葡萄糖的最适pH 为5.0 和9.0。

（4）地衣芽孢杆菌在生长繁殖过程中只能缓慢利用磷。