提取-共沸精馏耦合技术提取白术、桂枝挥发油工艺优化

李春花，李佳佳，顿佳颖，郭秋红，郑 鹏，张国红

（1.河北中医学院药学院，河北 石家庄 050200；2.河北中医学院科技处，河北 石家庄 050200；3.河北中医学院基础医学院，河北 石家庄 050200）

全国名老中医邢月朋长期从事心血管疾病诊治，根据多年临床经验积累，总结出治疗气虚血瘀、阳虚水停型充血性心力衰竭的经验方——葶苈生脉方，方中的白术、桂枝性味功效不尽相同，配伍使用所治病位既可走表，亦可走里，有通阳化气、健脾除湿、宣畅上下气机之功。现代医学研究表明，白术、桂枝主要有效成分白术内酯Ⅰ、桂皮醛具有抗炎、抗肿瘤、解热镇痛、抗菌等多种药理作用［1-7］。

目前在中药制剂生产中，挥发油提取大多采用水蒸气蒸馏法［8］，但用于提取水溶性较强的挥发油时提取效率较低，而提取-共沸精馏耦合技术对该类成分的提取有显著优势。考虑到白术、桂枝挥发油具有一定亲水性，本实验通过提取-共沸精馏耦合技术提取这些成分，采用正交试验优化该工艺，旨在提高挥发油得率及有效成分含有量，提高制剂工艺水平，保证药物疗效。

1 材料

1.1 仪器 购于美国Waters 公司的Waters e2695 高效液相色谱仪，配置2489 UV／Vis 检测器；购于美国安捷伦科技公司的安捷伦7890B 气相色谱仪，配置北京中惠普分析技术研究所的SPH-300 氢气发生器、SPB-3 全自动空气源；购于上海精科仪器厂的TG328B 分析天平；购于上海乐祺精密电子厂的LQ-A10002 电子天平；购于杭州法兰特超声波有限公司的FRQ-1008HT 超声波清洗器；购于天津市泰斯特仪器有限公司的98-1-B 型电子调温电热套；津隆针筒微孔滤膜，孔径 0.45 μm（有机系）。

1.2 材料

1.2.1 药材 白术（产地浙江磐安）、桂枝（产地广西）购于安国药材市场，经河北中医学院侯芳洁老师鉴定分别为菊科植物白术Atractylodes macrocephalaKoidz.的干燥根茎、樟科植物肉桂Cinnamomum cassiaPresl 的干燥嫩枝，符合2015版 《中国药典》 一部相关项下规定。

1.2.2 试药 购于深圳市中发源生物科技有限公司的分析纯无水硫酸钠；购于天津市永大化学试剂有限公司的分析纯无水乙醇；购于天津市大茂化学试剂厂的色谱纯乙腈、甲醇。购于上海源叶生物科技有限公司的桂皮醛（批号H02M6Q1，含有量 98%）、白术内酯Ⅰ（批号 ZM0311BC13，含有量98%）。

2 方法与结果

2.1 桂皮醛 GC 分析［9-12］

2.1.1 色谱条件 安捷伦HP-5 毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升温，初始温度 90 ℃，保持2 min，以 3 ℃ ／min 速率升至 140 ℃，保持 6 min，再以7 ℃ ／min速率升至 180 ℃，保持5 min；进样量1 μL，分流进样，分流比50 ∶1；载气N2，氢火焰离子化检测器（FID）；进样口温度200 ℃，检测器温度250 ℃。色谱图见图1。

图1 桂皮醛GC 色谱图

2.1.2 对照品溶液制备 精密称取桂皮醛对照品适量，甲醇溶解后置于 5 mL 量瓶中，定容，即得（质量浓度为2.19 mg／mL）。

2.1.3 供试品溶液制备 称取白术、桂枝适量，加8 倍量水浸泡2 h 后提取4 h，得到挥发油，无水硫酸钠干燥。无水乙醇溶解1 mL，置于5 mL 量瓶中，定容，即得。

2.1.4 线性关系考察 取 “2.1.2”项下对照品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 μL测定。以峰面积为纵坐标（Y），进样量为横坐标（X）进行回归，得到方程为Y=64 706X＋1.749 8（r=0.999 5），在2.19～10.95 μg 范围内呈良好的线性关系。

2.1.5 方法学考察 精密度试验中，桂皮醛峰面积RSD（n=6）为1.45%，表明仪器精密度良好；稳定性试验中，0、2、4、6、8、10 h 桂皮醛峰面积 RSD（n= 6）为0.80%，表明溶液在10 h 内稳定性良好；重复性试验中，桂皮醛含有量RSD（n=6）为1.00%，表明该方法重复性良好；加样回收率试验中，桂皮醛平均加样回收率为96.99% ，RSD 为（n=9）1.84% 。

2.2 白术内酯ⅠHPLC 分析［13-15］

2.2.1 色谱条件 YMC J′sphere ODS-H80-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，4 μm）；流动相乙腈-水，等度洗脱（60 ∶40）；体积流量 1.0 mL／min；柱温 30 ℃；检测波长220 nm；进样量 10 μL。色谱图见图2。

图2 白术内酯ⅠHPLC 色谱图

2.2.2 对照品溶液制备 精密称取白术内酯Ⅰ对照品适量，甲醇溶解后置于5 mL 量瓶中，定容，即得（质量浓度为 0.80 mg／mL）。

2.2.3 供试品溶液制备 同 “2.1.3”项。

2.2.4 线性关系考察 取 “2.2.2”项下对照品溶液，在“2.2.1”项色谱条件下进样 2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 μL测定。以峰面积为纵坐标（Y），进样量为横坐标（X）进行回归，得到方程为Y=970 991X-347 905（r=0.999 7），在1.62～8.03 μg 范围内呈良好的线性关系。

2.2.5 方法学考察 精密度试验中，白术内酯Ⅰ峰面积RSD（n=6）为 1.63%，表明仪器精密度良好；稳定性试验中，0、2、4、6、8、10 h 白术内酯Ⅰ峰面积 RSD（n=6）为1.38%，表明溶液在 10 h 内稳定性良好；重复性试验中，白术内酯Ⅰ含有量 RSD（n=6）为1.74%，表明该方法重复性良好；加样回收率试验中，白术内酯Ⅰ平均加样回收率为97.89%，RSD（n=9）为 1.63%。

2.3 提取工艺优化 选择浸泡时间（A，2、3、4 h）、提取时间（B，2、4、6 h）、加水量（C，8、10、12 倍）作为影响因素，挥发油提取率及桂皮醛、白术内酯Ⅰ总量的综合评分作为评价指标，采用L9（34）正交表安排试验，结果见表1～2。由表可知，各因素对提取工艺影响程度依次为 A＞B＞C，浸泡时间（A）有显著影响（P＜0.05），最佳水平组合为 A3B3C2，即浸泡时间3 h，提取时间 6 h，加水量10 倍。

表1 试验设计及结果

表2 方差分析

2.4 验证试验 按 “2.3”项下优化工艺进行3 批验证试验，结果见表3，可知该方法合理可行。

表3 验证试验结果（n=3）

3 讨论

目前，挥发油提取大多采用 《中国药典》 四部收录的水蒸气蒸馏法，该方法简便易行，但在提取过程中只经历了1 次气液传质和平衡过程，对含油量较低、水溶性较强的挥发油提取效率较低［16］。提取-共沸精馏耦合技术包含1个精馏塔，在挥发油富集过程中挥发性成分随水蒸气进入精馏塔，塔中填料使气、液两相逆流多级接触，完成多次气-液传质过程，从而提高了挥发油的提取率［17］。

白术挥发油的提取率与粒度有关［18-20］，本研究针对该因素进行预实验筛选。将白术粒度分为块状、最粗粉、细粉3种规格，发现最粗粉提取的挥发油含有量明显高于其他2种规格，而块状最低，其原因为块状白术中挥发油不易提出，如果提尽则耗工耗时；细粉在粉碎过程中挥发油可能会损失，同时在提取过程中易粘连于壁上，给操作造成不便。因此，确定将白术粉碎为最粗粉。

在 《中国药典》 一部中，采用HPLC 法测定桂皮醛含有量，但该方法上样量较大，对于本身含有量较低的挥发性成分并不适用。由于桂皮醛易挥发，故本实验采用GC法分析，该方法试样量少，并且检测灵敏，速度快，分离选择性好。升温速率与分流比对样品分离有重要影响，升温速率较大，分流比较小，将导致成分分离不彻底，分离度达不到要求；反之，则会造成分离时间较长，故本实验采用先慢后快的方式进行升温，在第一阶段以3 ℃／min 速率升温，使桂皮醛与其他成分有效分离；第二阶段以7 ℃／min速率升温，以尽快达到所需温度，并节省分析时间。

白术挥发油的主要成分为苍术酮，但其性质并不稳定，长时间加热与光照时会发生氧化分解，转化为白术内酯类成分，故本实验选择白术内酯Ⅰ作为评价指标。白术内酯Ⅰ是酯类成分，沸点较高，不宜采用GC 法测定，故本实验通过HPLC 法测定其含有量，同时由于该成分极性较小，故流动相中乙腈所占比例较大，最终确定流动相为乙腈-水（60 ∶40）。

致谢：本研究受到河北省科技计划项目基金资助，同时感谢科研中心张闯老师的帮助。