五味子醋蒸前后颜色及8种木脂素变化

戴 辉，苏 杭，蔡鹏飞，殷放宙∗，金 璇，李伟东，蔡宝昌

（1.南京中医药大学，江苏 南京 210023；2.南京市中医院，江苏 南京 210001）

五味子为木兰科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.的干燥成熟果实，始载于《神农本草经》，性酸、甘、温，归肺、心、肾经。具有收敛固涩、益气生津、补肾宁心之效。临床用于久嗽虚喘、梦遗滑精、遗尿尿频、久泻不止、自汗、盗汗、津伤口渴、短气脉虚、内热消渴、心悸失眠［1-2］。临床常用的五味子炮制品为五味子及醋五味子。生五味子多入嗽药，用于敛肺止咳止汗；醋蒸后增强酸涩收敛作用，涩精止泻作用更强。现代研究表明五味子以木脂素、有机酸、挥发油类等成分为主，其中木脂素成分为五味子中最主要的生物活性成分，具有保肝、抗氧化、抗肿瘤等药理作用［3-6］。2015版 《中国药典》 一部以五味子醇甲作为唯一指标对五味子炮制品进行质量控制，文献报道则集中在对五味子的木脂素成分含有量的分析［7］。实际上五味子生品为红色果实，在炮制加工过程中，颜色会逐渐加深变黑，醋五味子炮制以颜色的变化作为重要的控制指标。本实验采用分光测色仪量化了五味子炮制前后的颜色，并采用高效液相色谱法建立了五味子HPLC 指纹图谱，同时测定了炮制前后8种代表性的木脂素的含有量，以期为五味子炮制品的质量控制提供依据。

1 材料

CM-5 型分光测色仪（日本柯尼卡美能达有限公司）；Waters 2695-2998 型高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；Milli- Q3 超纯水处理系统（美国Millipore 公司）；MS-105DU 型电子天平（美国Mettler Toledo 公司）；KQ-500E 型超声仪（昆山市科导超声仪器有限公司）。

五味子醇甲（批号Y13D8H50595）、五味子醇乙（批号 P28S6F3984）、五味子酯甲（批号P13O8F45575）、五味子酯乙（批号 P07M6S1）、五味子酚（批号P13O8F45574）、五味子甲素（批号 R12O8F45508 ）、五味子乙素（批号P29J8F38066）、五味子丙素（批号 P28J8F36961）对照品均购自上海源叶生物科技有限公司。乙腈为色谱纯（美国Tedia 公司）；甲醇为分析纯（上海化学试剂有限公司）；水为超纯水。

五味子样品采自黑龙江、辽宁、吉林等地，经南京中医药大学李伟东教授鉴定为木兰科植物五味子Schisandra Chinensis（Turcz.）Baill.的干燥成熟果实。

2 方法与结果

2.1 醋五味子炮制 按照2015版 《中国药典》一部，即取收集到的10 批净五味子，照醋蒸法（通则0213）蒸至黑色。醋的用量为20%。

2.2 五味子炮制品颜色检测 采用分光测色仪对五味子不同炮制品进行颜色检测，客观量化生五味子（红色），醋五味子（黑色）的颜色值。

2.2.1 颜色检测条件 光源为脉冲氙灯，光源D65，标准观察角度 8°，照明口径 Φ3 mm，测量波长范围为360～740 nm，重复性标准偏差ΔΕ∗ab在0.07 以内，采用SCE 反射光模式进行测定。

2.2.2 供试品制备 每份样品粉碎（过3 号筛），各取10 g 放入检测皿中，重复测定色度3 次，以均数为最终测定结果。

2.2.3 方法学考察

2.2.3.1 不同测色模式对测色结果影响考察 测色时具有SCI 与SCE 2种测量模式。SCI 测量模式下，镜面反射光与漫反射光将同时测定，测出的值与观测者肉眼观察的物体颜色相当；SCE 测量模式下，镜面反射光被排除在外，只测定漫反射光，此与物体整体客观颜色相当，与物体表面条件无关。取同一批生五味子样品粉碎后，分别测定其SCI 值与SCE 值并比较，结果表明，2种测量模式下，SCI 与SCE 测量值相近。因此本实验只针对 SCE模式测定的结果进行分析［8］。

2.2.3.2 精密度试验 取同一批次五味子样品粉碎后进行测色方法的相应考察。连续采集同一份样品的颜色 6 次，测得 L∗、a∗、b∗的平均值分别为31.87、14.96、19.53，RSD分别为0.02%、0.03%、0.02%，表明该方法精密度良好。

2.2.3.3 稳定性试验 取同一份样品分别于0、2、6、8、10、12、18、24、36、48 h 进行颜色检测，测得 L∗、a∗、b∗的平均值分别为 31.87、14.96、19.53，RSD 分 别 为 0.03%、0.04%、0.06%，表明该方法稳定性良好。

2.2.3.4 重复性试验 取6 份样品分别置于检测皿中，进行颜色检测，测得 L∗、a∗、b∗的平均值分 别 为 31.84、14.96、19.59，RSD 分 别 为1.05%、1.92%、1.74%，表明该方法重复性良好。

2.2.4 样品检测 取10 批生五味子及对应的醋五味子粉碎过3 号筛，各取10 g 放入检测皿进行颜色检测，结果见表1。

2.3 五味子炮制品的指纹图谱建立及木脂素类成分含有量测定

2.3.1 对照品溶液制备 精密称取各对照品适量置10 mL 量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，分别配制成含 0.966 mg／mL 五味子醇甲、0.933 mg／mL 五味子醇乙、0.988 mg／mL 五味子酯甲、0.919 mg／mL 五味子酯乙、1.110 mg／mL 五味子甲素、1.008 mg／mL 五味子乙素、0.416 mg／mL五味子丙素以及0.454 mg／mL 五味子酚的对照品溶液。分别精密吸取各对照品母液适量至10 mL 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成含 386.4 μg／mL五味子醇甲、93.3 μg／mL 五味子醇乙、49.4 μg／mL五味子酯甲、45.95 μg／mL五味子酯乙、111.0 μg／mL五味子甲素、151.2 μg／mL 五味子乙素、20.8 μg／mL 五味子丙素以及 22.7 μg／mL 五味子酚的混合对照品溶液。

表1 各样品颜色测定结果Tab.1 Color measurement results of various samples

2.3.2 供试品溶液制备 取五味子样品粉末（过3 号筛）0.5 g，精密称定，精密加入甲醇 50 mL，称定质量，超声提取（功率250 W，频率20 kHz）30 min，放冷，再称定质量，甲醇补足减失质量，摇匀，过滤，挥去部分溶剂，用甲醇定容至25 mL，过 0.45 μm 微孔滤膜，即得。

2.3.3 色谱条件［9-10］Kromasil KR100-5 C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相水（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～15 min，2%～55% B；15～30 min，55%～60% B；30～50 min，60%～70% B；50～60 min，70%～100%B）；体积流量 1.0 mL／min；柱温30 ℃；进样量 10 μL。指纹图谱分析检测波长240 nm，参比波长380 nm，含有量测定检测波长250 nm。

2.3.4 线性关系考察 精密吸取混合对照品，注入高效液相色谱仪，以峰面积为纵坐标（Y），进样量为横坐标（X）进行回归，结果见表2。表明各成分在各自范围内线性关系良好。

2.3.5 方法学考察

2.3.5.1 精密度试验 精密吸取五味子供试品溶液，在 “2.3.3”项色谱条件下连续进样 6 次，测得各待测化合物峰面积RSD 均≤1.42%，表明仪器精密度良好。

2.3.5.2 稳定性试验 精密吸取五味子供试品，在 “2.3.3”项色谱条件下分别于 0、3、8、13、18、24 h 进样，测得各待测化合物峰面积 RSD 均≤1.98%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.3.5.3 重复性试验 分别取 6 份生五味子0.5 g，精密称定，按 “2.3.2”下方法制备供试品溶液，在 “2.3.3”项色谱条件下进样，测得各待测化合物的含有量RSD 均≤2.12%，表明该方法重复性良好。

2.3.5.4 加样回收率试验 取已知含有量的同一批五味子粉末5 份，每份0.25 g，精密称定，准确加入与样品中含有量等量的对照品，按 “2.3.2”下方法制备供试品溶液，在 “2.3.3”项色谱条件下进样，五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子酚、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素的平均加样回收率分别为100.81%、101.39%、100.07%、98.93%、100.49%、100.48%、101.19%、101.36%，RSD 分 别 为 1.03%、2.17%、2.22%、1.23%、2.48%、0.95%、1.06%、1.48%。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.3.6 指纹图谱建立 将不同批次的生及醋五味子饮片各10 批样品的液相色谱图导入 “中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”［11-14］，见图1，进行色谱峰匹配，将232（个匹配色谱峰峰面积）×20（个／样品）的数据矩阵导入 SIMCAP11 软件，进行 PCA 分析，见图2。

图1 10 批样品HPLC 指纹图谱Fig.1 HPLC fingerprints of ten batches of samples

图2 10 批样品主成分分析图Fig.2 PCA plot for ten batches of samples

2.3.7 样品含有量测定 取各批五味子炮制品粉末（过 3 号筛）0.5 g，精密称定，按 “2.3.2”下方法制备供试品溶液，在 “2.3.3”项色谱条件下进样，计算含有量，每批样品平行测定3 次。结果见图3、表3。

图3 各成分HPLC 色谱图Fig.3 HPLC chromatograms of various constituents

表3 各成分含有量测定结果（%）Tab.3 Results of content determination of various constituents（% ）

3 讨论

CIEL∗a∗b∗是国际照明委员会（CIE）于1976年推荐的均匀颜色模型，由于此模型充分符合人眼在红绿方向上的视觉色差尺度均小于黄、蓝方向的主观特征［15-16］，因此 CIEL∗a∗b∗颜色空间是目前涵盖颜色范围最广的模式。此模型用L∗、a∗、b∗3 个互相垂直的坐标轴来表示1 个色彩空间，L∗代表明度，黑在底端，白在顶端；a∗轴的正方向代表红色的变化，负方向代表绿色的变化；b∗轴正方向代表黄色的变化，负方向代表蓝色的变化。五味子在醋蒸后，颜色值 L∗、a∗、b∗均发生了明显的变化，其中尤以a∗值与b∗值变化最大，炮制后分别平均下降了61.55%、68.35%。炮制方法的描述主要依赖外观性状的变化来标示中药饮片的炮制程度，其中最主要是在加工过程中的颜色变化，所以应当考虑在饮片炮制过程中引入颜色变化的参数值来参与评判炮制程度，使其更加客观［17-18］。

实验过程中，在优化了样品提取方法、次数及时间的基础上建立了五味子的指纹图谱，并进行方法学考察。同时采用PCA 法对生、醋五味子样品作了区分。数据PC1 与PC2 对方差的累积贡献率＞82.3%，故提取前2 个主成分完全可表示样品的主要信息。沿着PC1 方向，生五味子和醋五味子可得到较好的区分，生五味子的PC1 值小于醋五味子的PC1 值，表明五味子经炮制后内在成分发生了一定的变化。实验中进一步采HPLC 法测定了五味子中代表性8种成分的含有量。结果表明各成分在炮制后均有一定程度的变化但无明显差异。由此可知不可仅从木脂素成分的差异上去解释五味子炮制后增加收敛作用的物质基础。醋蒸样品在色谱图7.5 min 左右出现的明显峰为5-羟甲基糠醛，由葡萄糖或果糖脱水生成，在炮制过程中易产生此类化合物。

实验中采用颜色评价、指纹图谱及含有量测定对五味子炮制品进行了分析评价，同时比较了醋蒸前后炮制品的差异。性状与内在成分相结合的方法可有效地实现对五味子炮制品的全面质量分析。实验过程中选定的可较多体现样品色谱信息的检测波长为240 nm，而在此波长下较为集中地体现了五味子的活性成分木脂素类的信息，含有量测定亦是围绕代表性的木脂素成分，由于木脂素成分较为稳定，因此五味子醋蒸前后在指纹图谱及含有量测定方面未见明显差异，同时木脂素成分与五味子的颜色变化相关性不大。因此后期考虑采用HPLC-MS等技术手段更加全面地分析样品成分信息，由此寻找五味子炮制前后成分差异及引起颜色变化的物质基础。