孕期地塞米松暴露可致雌性胎大鼠软骨发育不良及发生机制

黎 伟，秦 俊，文印宪，汪 晖，陈廖斌，3

（武汉大学1.中南医院骨科，2.基础医学院药理学系，3.发育源性疾病湖北省重点实验室，湖北 武汉 430071）

地塞米松作为一种合成类糖皮质激素（glucocorticoid，GC）可透过胎盘进入胎儿体内，促进胎肺等重要脏器成熟并降低呼吸窘迫综合征的发生风险［1-2］，因此被广泛应用于有早产风险的孕妇。近年来研究表明，孕期地塞米松暴露（prenatal dexamethasone exposure，PDE）不仅可抑制胎儿宫内发育，引起出生体质量和体长下降［3-4］，而且会导致出生后多种成年疾病易感［5］。近期，我们通过动物实验发现，PDE 具有子代关节软骨发育毒性［6］，但其发生机制尚不清楚。

蛋白聚糖（proteoglycan，PG）是软骨结构和功能的基础［7］，主要在关节软骨细胞外基质中大量聚集形成聚集PG，糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）是其主要成分。软骨组织中GAG 合成的关键在于四糖结构的合成，木糖基转移酶Ⅰ（O-xylosyltransferaseⅠ，XylT-Ⅰ），半乳糖基转移酶Ⅰ（β1，4-galactosyltransferase 7，GalT-Ⅰ），半乳糖基转移酶Ⅱ（β1，3-galactosyltransferase 6，GalT-Ⅱ）和葡萄糖醛酸转移酶Ⅰ（β1，3-glucuronosyltransferaseⅠ，GlcAT-Ⅰ）是“四糖结构”合成中的关键催化酶［8］。胰岛素样生长因子1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）是胎儿期软骨发育过程中重要的调节因子［9］。IGF-1 可通过IGF-1 受体（IGF-1 receptor，IGF-1R）刺激PI3K/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）信号通路［10］，促进软骨细胞的基质合成［11］。磷酸化的AKT可激活活化蛋白1（activator protein-1，AP-1）［12-13］，激活的AP-1 转运至胞核内与基因启动子区结合启动基因的表达［12］。研究发现，糖基转移酶（glycosyltransferases，GT）中的XylT-Ⅰ［14］，GalT-Ⅰ［15］和GlcAT-Ⅰ［16］基因启动子区均包含有AP-1 结合位点，可能参与GT基因表达的调控。本研究在前期已稳定建立的PDE 模型上，研究子代宫内关节软骨发育，以阐明PDE对子代关节软骨IGF-1/AKT/AP-1通路及GT对软骨发育影响的作用机制，为研究PDE致子代胎软骨发育毒性提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 药品和试剂

地塞米松购自武汉双鹤公司；异丙醇和三氯甲烷购自上海药化公司；IGF-1R抑制剂NVP-AEW541和AKT 抑制剂MK-2206 购自上海蓝木化工公司；AP-1 抑制剂SR-11302 购自美国R & D Systems 公司；Trizol 购自美国Invitrogen 公司；逆转录试剂盒及实时定量试剂盒购自大连宝生物工程公司；青链双抗、RIPA 裂解液及蛋白定量试剂盒（BCA）均购自碧云天公司；兔抗IGF-1多克隆抗体，小鼠抗AKT单克隆抗体，兔抗AP-1多克隆抗体，小鼠抗GlcAT-Ⅰ单克隆抗体和小鼠抗XylT-Ⅰ单克隆抗体购自美国Santa Cruz 公司；兔抗GalT-Ⅰ单克隆抗体购自美国Abcam 公司；辣根过氧化酶标记二抗（山羊抗兔IgG 和山羊抗小鼠IgG）购自美国Pierce Biotechnology 公司；Ⅱ型胶原酶、硫酸软骨素和DMB试剂均购自科瑞生物公司；引物均由上海生工合成；其他试剂均为国内分析纯。

1.2 动物处理

于湖北省疾病预防控制中心购买成年健康雌性（180～220 g）和雄性（260～300 g）Wistar 大鼠（合格证号：420006-00002258），实验动物使用许可证号SCXK（鄂）2012-2014。大鼠适应性喂养1周后，每晚按每笼6雌3雄合笼，次日上午进行雌鼠阴道涂片镜检，以查到精子之日计为受孕0天（gestational day 0，GD0）。受孕大鼠随机分正常对照组和PDE 组，每组8 只。PDE 组从GD9 起sc 给予地塞米松0.2 mg·kg-1，连续给药至GD20；正常对照组给予相同剂量的生理盐水。基于本室前期研究发现，孕期外源物暴露所致雌性子代软骨发育不良及胎源性骨关节炎易感［17-18］，在GD20用异氟烷麻醉孕鼠，剖腹取出雌性胎鼠并收集膝关节组织。

1.3 雌性胎大鼠膝关节软骨细胞的制备

另取GD20 Wistar 孕鼠颈椎脱位法处死［18］，在75%乙醇浸泡10 min，剖腹取出雌性胎鼠，超净台内无菌削取标本得到关节软骨片，剪成1 mm3小块。用0.2%Ⅱ型胶原酶37℃水浴消化2～4 h 成絮状。加入全培养液重悬，获得软骨细胞悬液。将细胞接种于培养瓶内单层培养。隔天换液，待细胞基本长满后传代培养。传至第3 代时，调整细胞密度为1x108L-1接种于培养板培养，并给予地塞米松（100 和500 nmol·L-1），IGF-1（100 μg·L-1），NVPAEW541（1 μmol·L-1），MK-2206（1 μmol·L-1）和SR-11302（1 μmol·L-1）处理24 h，收集细胞和细胞上清液，应用DMB检测细胞上清GAG含量，实时定量PCR 和Western 蛋白印迹法检测细胞IGF-1/AKT/AP-1 通路相关蛋白及XylT-Ⅰ，GlcAT-Ⅰ和GalT-Ⅰ基因和蛋白表达。

1.4 HE和番红O染色观察雌性胎大鼠膝关节软骨组织形态

将胎大鼠膝关节固定于中性甲醛，1 d 后直接脱水包埋固定。每组随机选取5 个膝关节标本，将其切成厚度为5 μm的矢状位切片，进行HE和番红O染色，在医学光学显微镜下观察软骨组织形态。

1.5 免疫组化法检测雌性胎大鼠膝关节软骨组织lGF-1，AKT，AP-1，XylT-Ⅰ，GalT-Ⅰ和GlcAT-Ⅰ蛋白表达

按SP免疫组化染色试剂盒及DAB显色试剂盒说明书进行。采用ImagePro-6.0 软件进行图形半定量分析，每张照片在关节软骨区采集10个区域，计算平均吸光度值（mean absorbance，MA），并进行统计学分析。

1.6 DMB染色法检测雌性胎大鼠膝关节软骨细胞上清GAG含量水平

取400 μL 各组软骨细胞的培养上清液，加入1 mL 木瓜蛋白酶消化液，60℃消化60 min，加入20 mmol·L-1碘酸和50 mmol·L-1的Tris-HCl，再加入DMB显色剂2.5 mL，加入双蒸水将每个样本定容到4 mL，充分混匀，反应15 s后，于分光光度仪525 nm波长处测定吸光度。以硫酸软骨素作为标准品等比稀释制定标准曲线，计算样本中GAG的含量。

1.7 Western蛋白印迹法检测雌性胎大鼠膝关节软骨细胞中XylT-Ⅰ，GlcAT-Ⅰ和GalT-Ⅰ蛋白表达水平

RIPA裂解液提取细胞总蛋白。BCA法检测样本蛋白质浓度，并将其调整为2.5 g·L-1，加入5×蛋白上样缓冲液后100℃水浴10 min，-20℃保存。配制5%浓缩胶和分离胶，电泳，醋酸纤维膜转印。5%脱脂奶粉室温封闭2 h，4℃下加一抗〔GlcAT-Ⅰ（1∶500），XylT-Ⅰ（1∶500）或GalT-Ⅰ（1∶1000）〕孵育过夜。TBST洗膜3次，室温下二抗（1∶5000）孵育2 h。TBST 洗膜3 次，ECL 显色剂显影。Chemi-doc Image Analyzer系统拍照记录。Image Tool 3.0软件分析蛋白条带积分吸光度，以目的蛋白与内参蛋白积分吸光度的比值表示其相对表达水平。

1.8 实时定量PCR检测雌性胎大鼠膝关节软骨组织中蛋白聚糖及膝关节软骨组织和软骨细胞XylT-Ⅰ，GlcAT-Ⅰ，GalT-Ⅰ，IGF-1，IGF-1R，AKT和AP-1mRNA表达水平

Trizol 试剂提取总RNA。总RNA 浓度调整为300 mg·L-1后逆转录，调整cDNA浓度1000 mg·L-1，实时定量PCR 检测mRNA 表达水平。PCR 条件（表1）为：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，退火30 s，72℃延伸30 s，后3 步设40 循环。以2-ΔΔCt表示目的基因mRNA相对表达水平。

Tab.1 Primer sequences and optional PCR conditions

1.9 统计学分析

实验结果数据均以±s表示，采用SPASS 17.0系统对数据进行统计分析，多组间比较用单因素方差分析，两两比较采用t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 孕期地塞米松暴露对雌性胎大鼠关节软骨组织发育和基质合成的影响

HE 染色结果显示，PDE 组雌性胎大鼠关节软骨未见明显结构紊乱，但其软骨细胞数减少，表层软骨细胞排列紊乱。番红O染色结果显示，PDE组出现关节软骨基质染色着色变浅、着色不均一等现象（图1）。提示PDE组雌性胎大鼠宫内时期关节软骨基质含量降低，且关节软骨发育不良。

Fig.1 Effect of prenatal dexamethasone exposure（PDE）on chondrogenesis knee articular cartilage in offspring female fetal rats by HE staining and Safranin O staining.From gestational day 9（GD9），pregnant Wistar rats were sc given daily dexamethasone 0.2 mg·kg-1.On GD20，pregnant rats were anesthetized and knee tissue of female fetal rats was collected.

2.2 孕期地塞米松暴露对雌性胎大鼠膝关节软骨组织XylT-Ⅰ，GlcAT-Ⅰ，GalT-Ⅰ和lGF-1/AKT/AP-1通路相关蛋白表达水平的影响

免疫组化结果显示（图2A），与正常对照组相比，PDE组雌性胎大鼠膝关节软骨基质中XylT-Ⅰ，GlcAT-Ⅰ，GalT-Ⅰ，IGF-1，AKT 和AP-1 蛋白表达降低（P＜0.05，P＜0.01，图2B），提示PDE 可导致雌性胎大鼠宫内期软骨关节组织中XylT-Ⅰ，GlcAT-Ⅰ，GalT-Ⅰ和IGF-1/AKT/AP-1通路蛋白表达水平降低。

Fig.2 Effect of PDE on expression of XylT-Ⅰ,GlcAT-Ⅰ，GalT-Ⅰand proteins related to lGF-1/AKT/AP-1 signaling pathway of knee articular cartilage in offspring fetal female rats by immunohistochemical assays.See Fig.1 for the rat treatment.MA：mean absorbance.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=5.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

2.3 孕期地塞米松暴露对雌性胎大鼠膝关节软骨组织蛋白聚糖，XylT-Ⅰ，GlcAT-Ⅰ，GalT-Ⅰ和lGF-1/AKT/AP-1通路相关蛋白mRNA表达的影响

与正常对照组相比，PDE组雌性胎大鼠关节软骨中蛋白聚糖，XylT-Ⅰ，GlcAT-Ⅰ，GalT-Ⅰ，IGF-1，IGF-1R，AKT和AP-1mRNA 表达水平降低（P＜0.05，P＜0.01，图3），提示PDE可导致雌性胎大鼠宫内时期关节软骨组织中蛋白聚糖，XylT-Ⅰ，GlcAT-Ⅰ，GalT-Ⅰ和IGF-1/AKT/AP-1 通路相关蛋白mRNA表达水平降低。

Fig.3 Effect of PDE on mRNA expression of aggrecan，XylT-Ⅰ，GlcAT-Ⅰ，GalT-Ⅰand proteins related to lGF-1/AKT/AP-1 signaling pathway in knee articular cartilage of offspring fetal female rats.See Fig.1 for the rat treatment.±s，n=8.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

2.4 地塞米松对雌性胎大鼠膝软骨细胞GAG含量的影响

DMB法检测细胞上清GAG含量，结果显示（图4），与正常对照组相比，地塞米松100和500 nmol·L-1组软骨细胞上清GAG 含量不同程度降低（P＜0.05）；与地塞米松500 nmol·L-1组相比，同时加入IGF-1 100 μg·L-1处理后，GAG含量升高（P＜0.05）。

Fig.4 Effect of dexamethasone on glycosaminoglycan（GAG）content of offspring fetal rat chondrocytes.GD20 pregnant Wistar rats were sacrificed by cervical dislocation method，and female fetal articular cartilage slices were extracted to prepare chondrocyte suspension.Different drugs were treated for 24 h.±s，n=5.＊P＜0.05，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with dexamethasone 500 nmol·L-1 group.

2.5 地塞米松对雌性胎大鼠软骨细胞XylT-Ⅰ，GlcAT-Ⅰ，GalT-Ⅰ和lGF-1/AKT/AP-1通路相关蛋白mRNA表达水平的影响

与正常对照组相比，地塞米松100和500 nmol·L-1组软骨细胞XylT-Ⅰ，GlcAT-Ⅰ，GalT-Ⅰ，IGF-1R，AKT和AP-1mRNA 表达水平均呈不同程度降低（P＜0.05，P＜0.01，图5），提示地塞米松可降低XylT-Ⅰ，GlcAT-Ⅰ，GalT-Ⅰ和IGF-1/AKT/AP-1通路相关蛋白mRNA表达水平。与地塞米松500 nmol·L-1组相比，同时给予IGF-1 100 μg·L-1，上述mRNA表达水平均升高（P＜0.05，P＜0.01）。提示IGF-1可逆转地塞米松的抑制作用。

Fig.5 Effect of dexamethasone on mRNA expression of XylT-Ⅰ，GlcAT-Ⅰ，GalT-Ⅰand proteins related to lGF-1/AKT/AP-1 signaling pathway of fetal female rat chondrocytes.See Fig.4 for the cell treatment.±s，n=5.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with dexamethasone 500 nmol·L-1 group.

2.6 lGF-1和lGF-1R/AKT/AP-1抑制剂对雌性胎大鼠膝关节软骨细胞XylT-Ⅰ，GlcAT-Ⅰ和GalT-ⅠmRNA表达的影响

与正常对照组相比（图6），IGF-1处理组XylT-Ⅰ，GlcAT-Ⅰ和GalT-ⅠmRNA表达水平升高，IGF-1R/AKT/AP-1 各抑制剂处理组XylT-Ⅰ，GlcAT-Ⅰ和GalT-ⅠmRNA 表达水平降低（P＜0.05，P＜0.01），提示IGF-1 增加GTmRNA 表达水平，而IGF-1R/AKT/AP-1 各抑制剂降低GTmRNA 表达水平。与单独SR-11302 组相比，同时加入IGF-1 处理后，XylT-Ⅰ，GlcAT-Ⅰ和GalT-ⅠmRNA 表达水平变化不明显。提示IGF-1不能消除SR-11302对XylT-Ⅰ，GlcAT-Ⅰ和GalT-ⅠmRNA表达水平的抑制作用。

Fig.6 Effect of lGF-1，lGF-1R inhibitor（NVP-AEW541），AKT inhibitor（MK-2206）and AP-1 inhibitor（SR-11302）on mRNA expression of XylT-Ⅰ，GlcAT-Ⅰand GalT-Ⅰof fetal female rat chondrocytes.Chondrocytes were treated with IGF-1 100 μg·L-1 AVP-AEW541 1 μmol·L-1，MK-2206 1 μmol·L-1 and SR-11302 1 μmol·L-1 for 24 h，respectively.±s，n=5.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

2.7 lGF-1和lGF-1R/AKT/AP-1各抑制剂对雌性胎大鼠膝软骨细胞XylT-Ⅰ，GlcAT-Ⅰ和GalT-Ⅰ蛋白表达水平的影响

Western 蛋白印迹结果（图7）显示，与正常对照组相比，IGF-1处理组XylT-Ⅰ，GlcAT-Ⅰ和GalT-Ⅰ蛋白表达水平升高，IGF-1R/AKT/AP-1各抑制剂处理组XylT-Ⅰ，GlcAT-Ⅰ和GalT-Ⅰ蛋白表达水平降低（P＜0.05，P＜0.01），提示IGF-1 增加XylT-Ⅰ，GlcAT-Ⅰ和GalT-Ⅰ蛋白表达水平；而IGF-1R/AKT/AP-1 各抑制剂降低XylT-Ⅰ，GlcAT-Ⅰ和GalT-Ⅰ蛋白表达水平。与单独SR-11302 组相比，同时加入IGF-1 处理后，XylT-Ⅰ，GlcAT-Ⅰ和GALT-Ⅰ蛋白表达水平变化不明显。提示IGF-1 不能消除SR-11302 对XylT-Ⅰ，GlcAT-Ⅰ和GalT-Ⅰ蛋白表达水平的抑制作用。

Fig.7 Effect of lGF-1，NVP-AEW541，MK-2206 and SR-11302 on protein expression of XylT-Ⅰ，GlcAT-Ⅰand GalT-Ⅰof fetal female rat chondrocytes.See Fig.6 for the cell treatment.B1-B3 were the semiquantitative results of A.IA：integrated absorbance.±s，n=5.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

3 讨论

本研究在体实验发现，PDE可导致雌性胎大鼠关节软骨发育不良，表现为关节软骨基质含量降低，PG含量显著减少，同时IGF-1/AKT/AP-1通路相关蛋白mRNA 和XylT-Ⅰ，GlcAT-Ⅰ及GalT-ⅠmRNA和蛋白表达降低。体外实验发现，地塞米松可导致软骨细胞上清GAG 水平降低，同时IGF-1/AKT/AP-1 通路相关蛋白和XylT-Ⅰ，GlcAT-Ⅰ及GalT-ⅠmRNA表达降低。

关节软骨主要在胚胎期生成并发育成熟，在这一过程中软骨细胞增殖、体积变大并分泌细胞外基质［19］。研究表明，PDE 可导致子代关节软骨变薄，软骨细胞数目减少［20］。本研究结果表明，PDE子代雌性胎鼠在GD20 时，软骨细胞数目减少、排列紊乱，细胞外基质aggrecan 含量显著降低。提示PDE可致关节软骨发育毒性，其主要表现为关节软骨基质含量降低。

PG 含有多种组成成分，其中GAG是其主要成分［21］。XylT-Ⅰ，GALT-Ⅰ，GalT-Ⅱ和GlcAT-Ⅰ为四糖结构合成的关键酶［22］。研究表明，应用siRNA技术沉默HeLa细胞GalT-Ⅱ基因可急剧减少GAG的合成［23］。本室前期研究表明，抑制大鼠软骨细胞XylT-Ⅰ和GlcAT-Ⅰ基因表达可抑制GAG 的合成［24］。以上说明XylT-Ⅰ，GalT-Ⅰ和GlcAT-Ⅰ在GAG 合成中起着重要作用。本研究结果表明，在GD20 时，PDE 组胎大鼠关节软骨局部XylT-Ⅰ，GalT-Ⅰ和GlcAT-Ⅰ的mRNA 和蛋白水平降低，这些改变与软骨细胞外基质PG含量下降一致。体外实验结果表明，软骨细胞给予地塞米松处理后，XylT-Ⅰ，GalT-Ⅰ和GlcAT-ⅠmRNA 表达下降，细胞上清GAG水平也降低，提示关节软骨基质含量降低可能源于地塞米松所致XylT-Ⅰ，GalT-Ⅰ和GlcAT-ⅠmRNA表达降低后GAG合成不足。

已有文献提示，IGF-1对宫内期胚胎生长和组织发育起到重要作用［25］，通过与其受体IGF-1R 结合后，活化酪氨酸蛋白激酶，进而磷酸化PI3K/AKT，引起细胞增殖、分化和代谢等功能变化［26］。本研究结果表明，PDE可致雌性胎鼠软骨IGF-1/AKT/AP-1通路相关蛋白表达降低。据报道，地塞米松可抑制多种组织或细胞内IGF-1基因表达［27-28］。本研究体外实验结果表明，地塞米松可抑制IGF-1/AKT/AP-1通路相关蛋白表达，IGF-1可逆转地塞米松对IGF-1/AKT/AP-1 通路相关蛋白的抑制作用。有文献提示，IGF-1R/AKT/AP-1 抑制剂可抑制IGF-1 通路介导的软骨细胞PG 合成［29］。因此，未进一步研究地塞米松处理后AKT反向激活下对软骨细胞PG合成的影响。本研究体外实验结果表明，IGF-1可升高软骨细胞XylT-Ⅰ，GalT-Ⅰ和GlcAT-ⅠmRNA和蛋白表达水平，IGF-1R/AKT/AP-1 各抑制剂均可降低软骨细胞XylT-Ⅰ，GalT-Ⅰ和GlcAT-ⅠmRNA和蛋白表达水平，IGF-1联合AP-1抑制剂SR-11302不能消除AP-1抑制剂的抑制效应，说明AP-1在调节XylT-Ⅰ，GalT-Ⅰ和GlcAT-Ⅰ表达方面起关键作用。以上结果提示，地塞米松通过IGF-1/AKT/AP-1信号通路抑制XylT-Ⅰ，GalT-Ⅰ和GlcAT-ⅠmRNA和蛋白表达。

综上所述，PDE可致雌性胎大鼠软骨发育不良，其机制可能是PDE致关节软骨IGF-1/AKT/AP-1通路低活性，降低XylT-Ⅰ，GalT-Ⅰ和GlcAT-ⅠmRNA和蛋白表达，从而抑制软骨基质合成。本研究为探寻地塞米松对关节软骨发育毒性作用机制提供了理论和实验依据。