Leber遗传性视神经病相关的三种原发性线粒体突变的无创检测方法建立

王敏，吕媛媛，薛凌，郑斌娇，管敏鑫

（温州医科大学 检验医学院 生命科学学院 Attardi线粒体生物医学研究院，浙江 温州 325035）

Leber遗传性视神经病变（Leber’s hereditary optic neuropathy，LHON）是一种主要累及青年男性，导致双眼快速无痛性视力减退的母系遗传性眼病。1871年首次出现对该病症状及遗传特性的报 道[1-2]。线粒体DNA（mitochondria DNA，mtDNA）突变是该病的分子致病基础之一[3-4]。m.11778G＞A、m.14484T＞C和m.3460G＞A突变位点是最主要的引起LHON发病的原发位点[3，5-9]。在欧洲人群中，由这3个原发突变位点引起的LHON患者占90%～95%，而在中国人群中3 个突变位点只占约50%[10-11]。LIANG等[11]对1 218例中国汉族LHON家系统计分析，发现m.11778G＞A、m.14484T＞C和m.3460G＞A突变分别占总人数36.12%、4.84%和1.48%，与JIA等[12]对903例中国LHON人群3个原发性突变位点的检测基本一致（分别为34.6%、3.3%和0.4%）。因此，筛查LHON患者线粒体基因组中是否存在3个原发突变，成为LHON的重要诊断标准[13]。众所周知，血液样本是基因组DNA的极佳来源，然而在流行病学调查中，需要采集大量样本，抽取血液样本很困难且是侵入性的，所以常需要替代来源。根据之前的报道，从口腔黏膜细胞分离的DNA已成功用于基因检测分析[14-16]。在本研究中，使用口腔拭子收集口腔黏膜细胞来提取DNA，该研究分2个阶段进行。第一阶段，将口腔黏膜细胞样本与血液样本提取的DNA从DNA浓度、纯度和完整性各方面进行比较。第二阶段，进行了基于PCR的焦磷酸测序、斑点杂交和Southern blot分析，以评估使用口腔黏膜细胞DNA检测m.11778G＞A、m.14484T＞C和m.3460G＞A突变的可行性。

1 对象和方法

1.1 对象 在温州医科大学附属眼视光医院就诊的3例基因检测确定为m.11778G＞A、m.14484T＞C和m.3460G＞A突变的LHON患者和2个无血缘关系且身体健康的对照样本（C049、C003）。根据《赫尔辛基宣言》原则，患者在参加本研究之前认真阅读并签署知情同意书，本研究经温州医科大学伦理委员会批准。对受检者进行血液样本和口腔黏膜细胞样本的采集。受检者必须在采集样本前1 h内避免吸烟、饮酒或进食，以减少食物颗粒或其他外源物质影响样品的可能性[12]。所有参与者在样本收集前需用自来水漱口10 s，然后用棉签刮左侧脸颊内部上下牙床处黏膜，用刷牙的力度上下擦动，同时旋转拭子，让拭子头部充分接触口腔黏膜，重复此动作上下刮拭10次，最后用同样的方法刮右侧口腔黏膜，采集口腔拭子3根。将棉签风干30～60 min并置于密封的干燥剂塑料袋中。同时，受检者自愿提供2 mL外周血，血液样本储存在抗凝管中。然后将口腔黏膜细胞样本和血液样本立即送到实验室，并在4 ℃下储存以防止DNA降解。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取和定量：①手工法：使用无菌镊子将风干棉签表面上的棉花撕脱，并转移到含有600 μL 细胞裂解缓冲液和3 μL蛋白酶K的2 mL无菌离心管中。将混合物在55 ℃裂解12 h。孵育完成后，向混合物中加入600 μL预冷的乙酸钾，并将混合物在冰上静置10 min。然后将混合物离心：4 ℃、 12 000 r/min、10 min。将上清液转移到1.5 mL无菌离心管中，并加入600 μL预冷的异丙醇。混匀后，将混合物在4 ℃下以12 000 r/min离心10 min。弃上清液，用600 μL无水乙醇将沉淀物重悬，并在室温下以12 000 r/min离心3 min。弃上清液。65 ℃、40 min干燥DNA后，向离心管中加入50 μL ddH2O溶解DNA。用分光光度法测DNA在260 nm和280 nm处的吸光度值来测定全基因组DNA的浓度和纯度。②试剂盒法：根据口腔拭子的规格，使用QIA amp DNA Mini Kit（50）按照说明书提取口腔黏膜细胞DNA。根据HiPure Tissue DNA Mini Kits说明书来提取血液DNA。通过分光光度法测DNA在260 nm和280 nm处的吸光度值来测定全基因组DNA的浓度和纯度。通过将DNA浓度与DNA样品的最终体积相乘来计算DNA产量。

1.2.2 m.11778G＞A、m.14484T＞C和m.3460G＞A 突变检测：针对存在m.11778G＞A、m.14484T＞C 和m.3460G＞A突变的鉴定详见文献[17]。使用特异性寡核苷酸引物对突变者的包含突变位点的DNA片段进行PCR扩增，即扩增含m.G11778A突变的11 654～11 865片段、含m.T14484C突变的14 260～14 510片段、含m.G3460A突变的3 108～3 717片段[18]。具体来讲，为了检测m.T14484C突变，以全基因组DNA为模板，用mtDNA 14 000～14 998位置对应的PCR特异性引物来扩增得到第1段PCR产物，以排除可能的核假基因的共扩增[19]。然后，以第1 段PCR产物作为模板，用m.DNA 14 260～14 510位置的特异性引物来扩增得到第2段PCR产物（251 bp）。然后取1 μL提取的DNA，PCR反应总体系为25 μL，包含2 pmol/L相应的特异性引物、 5 mol/L dNTP、37.5 pmol/L MgCl2、2 μL 10× ExTaqbuffer（不含Mg2+）、0.5 U Taq DNA聚合酶和 18 μL ddH2O。PCR反应程序为预变性94 ℃ 3 min、变性94 ℃ 30 s、退火56 ℃ 45 s、延伸72 ℃ 30 s、35 个循环，最终延伸72 ℃ 5 min，4 ℃保存。5 μL扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，确定特异性的扩增条带后，将10 μL扩增产物送上海六合华大基因科技公司测序，测序结果使用CodonCode Aligner软件与经过校正的剑桥标准序列（GenBank输入编号：NC_001807）进行比对，发现突变位点后用Chromas 2.0软件读取测序结果的峰图文件，进行确认或排除。

1.2.3 斑点杂交：将25 ng PCR产物直接加载到带正电荷的尼龙膜（Roche）上，用寡脱氧核苷酸探针进行杂交分析。为了检测MT-ND4 m.11778G＞A突变，使用特异性非放射性地高辛（digoxigenin，DIG）标 记的寡脱氧核苷酸探针：5’-ATGATGCGACTGTGAGTGC GT-3’；对于MT-ND6 T14484C突变，使用探针：5’-ATGA TGGTTGTCTTTGGAT-3’；对于MT-ND1 G3460A突变，使用探针：5’-GGCGTCAGCGAAGGGTTGTAG-3’。通过用DIG Oligo-nucleotide Tailing Kit（Roche）使寡脱氧核苷酸探针标记上DIG。将尼龙膜放在含有5 mL DIG Easy Hyb（Roche）杂交液的杂交瓶中，56 ℃杂交炉中杂交16 h。杂交后，洗膜程序为：尼龙膜在室温下在2×SSC ＆ 0.1% SDS中洗涤2次，每次 5 min；然后在37 ℃，0.5×SSC ＆ 0.1% SDS中洗涤2次，每次15 min；用DIG Wash and Block buffer、 Anti-digoxigenin-AP、Fab fragments和CDP-Star（Ro-che）检测DIG标记的探针[20-22]。

1.2.4 Southern blot：将50 ng PCR产物进行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳。然后，将凝胶上的PCR产物电转印迹到带正电的尼龙膜（Roche）上，55 ℃杂交探针过夜，第2天检测探针，方法同上。

1.3 统计学处理方法 使用SPSS18.0进行统计学分析，计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DNA浓度和纯度比较 手工法和试剂盒法从口腔黏膜细胞和血液样本中提取的DNA浓度的差异无统计学意义（P＞0.05）。手工法提取的口腔黏膜细胞DNA纯度低于用试剂盒法提取的口腔黏膜细胞和血液样本DNA的纯度，差异有统计学意义（P＜0.05）。说明了口腔黏膜细胞用2种方法提取的DNA产量与血液样本相似，但是用试剂盒法提取的DNA的纯度更高。见表1。

表1 不同样本来源的DNA浓度和纯度的比较（±s）

表1 不同样本来源的DNA浓度和纯度的比较（±s）

与试剂盒法比：aP ＜0.05

DNA来源 n DNA浓度（ng/μL） DNA纯度（A260/A280） DNA总量（μg）口腔黏膜拭子 手工法 5 47.0±12.0 1.37±0.19a 2.35±0.60 试剂盒法 5 50.4± 9.9 1.70±0.08 2.52±0.49静脉血 5 55.6± 7.3 1.81±0.01 2.78±0.37

2.2 来自口腔黏膜细胞和血液样本鉴定m.G11778A、 m.T14484C和m.G3460A突变的比较 对口腔黏膜细胞和血液样本DNA经PCR扩增，纯化PCR产物后进行DNA测序分析。结果显示口腔黏膜细胞样本和血液样本的测序结果一致，突变组均可以检测到相应的点突变，而对照组DNA为野生型。2种样本用测序方法检测m.G11778A、m.T14484C和m.G3460A突变的结果一致，初步说明口腔黏膜细胞可以用于检测这3个点突变。见图1。

2.3 斑点杂交和Southern blot检测口腔黏膜细胞和血液样本突变的比较 采用斑点杂交和Southern blot分析检测受检者是否存在m.G11778A、m.T14484C 和m.G3460A突变。可以检测到没有这些突变位点的对照组样本，而不能检测到具有这些点突变的突变组样本。此外，斑点杂交和Southern blot分析结果表明，从DNA1、DNA2和DNA3扩增的3种PCR产物的结果差异无统计学意义（P＞0.05）。进一步验证了用患者的口腔黏膜细胞可以用于m.G11778A、m.T14484C和m.G3460A突变的检测。见图2。

图1 3个突变组（WZ1345、WZ1481、WZ1478）和2个对照组（C049、C003）样品的部分测序峰图

图2 斑点杂交和Southern blot检测口腔黏膜细胞和血液样本突变的比较

3 讨论

LHON是一种遗传性疾病，来自不同种族背景的80%～95%的LHON家系被诊断为具有3种主要的线粒体G11778A、T14484C和G3460A突变[10]。本研究表明，使用口腔拭子进行DNA收集用来检测线粒体G11778A、T14484C和G3460A突变是可靠的。口腔拭子可提取足够量的DNA，其纯度足以进行PCR及后续的测序试验等，并且与血液样本一样准确[23-24]。同时口腔拭子收集是无创的，可以很容易地在家里进行[25-26]。对于所有研究对象，从口腔黏膜细胞和血细胞中提取的DNA确定的测序结果、斑点杂交结果和Southern blot结果是相同的。此外，口腔拭子可以在没有医疗监督的情况下收集，也适用于婴幼儿，并且结果不受室温条件的影响[26]。这提供了在没有静脉采血条件的家庭和中心收集的机会，因为口腔拭子可以通过标准邮件轻松地邮寄到基因检测实验室，这也降低了筛选高危人群中LHON基因的门槛。总之，通过简单的口腔拭子技术收集的口腔黏膜细胞的DNA是血液细胞DNA的准确且实用的无创替代物，可用于LHON的3个主要点突变的检测。

与从血液样品中分离DNA相比，口腔拭子方法的局限性是较低的DNA量和质量。因此，对于获得的材料用于临床或研究目的大的其他LHON相关的突变的测量是有限的。另一个需要考虑的重要问题是在家中家庭成员之间交换口腔拭子的风险。最后，与从血细胞中分离DNA相比，从口腔拭子中分离DNA因为孵育时间更长，所以更耗时。然而，与静脉穿刺消耗的成本相比，用口腔拭子收集DNA的劳动强度更低[27]。

综上所述，本研究结果表明，使用口腔拭子从口腔黏膜细胞中收集DNA可提供数量足够和质量良好的DNA，用于LHON相关的3种主要线粒体点突变的检测。口腔拭子也可以用作自我管理的邮寄测试，使用这种方便的无创技术，更有利于弱势群体（如儿童）的LHON相关的3种原发性线粒体突变的筛查。