基于GC-MS分析酸雨与镉复合胁迫对玉米幼苗代谢物的影响

王振涛，解静芳，李 萌，陈佳月

（1.山西大学环境与资源学院，山西 太原 030006；2.中国科学院上海硅酸盐研究所，上海 200050）

酸雨（Acid rain，AR）是指 pH 值小于 5.6 的降水[1]，可造成土壤酸化、伤害动植物、腐蚀建筑物等[2-3]。镉（Cadmium，Cd）是含有毒性的重金属元素[4]，环境中存在的Cd 会对植物产生毒害效应，干扰植物新陈代谢，严重时会导致植物枯萎甚至死亡[5-6]。土壤中Cd 的溶解度随AR 强度的增大而增加，而AR 和Cd 复合胁迫会破坏植物的生长环境[7]。有研究表明，短期不同浓度Cd 胁迫诱使红树根系分泌的有机酸含量增多[8]，Cd 诱导菠菜多种氨基酸、多种糖类物质、苹果酸和柠檬酸含量升高[9]，AR 会对植物光合系统、呼吸作用及物质代谢产生影响[10]。

AR 与Cd 作为2 种重要的环境污染物，均会对植物的生长和代谢造成影响。目前，国内外对AR和Cd 的相关研究多集中于二者复合胁迫对植物生长、生理及光合作用等的影响方面[11-12]，而从代谢的角度分析二者复合胁迫对玉米幼苗的作用机制还未见报道。气相色谱-质谱（GC-MS）方法具有高分离效能的毛细管色谱柱和高灵敏度的质谱检测定性能力[13]，其对于代谢物的鉴定具有一定的优势，样品进行衍生化处理后，可以检测到的代谢物包括糖类、氨基酸、有机酸等极性较大的化合物，也能检测到极性较小的化合物如脂肪酸。

本试验通过GC-MS 方法研究AR 单一胁迫和AR 与Cd 复合胁迫对玉米幼苗代谢物的影响，以期厘清其影响作用机制，为AR 与Cd 联合污染对作物生长的干预和土壤污染修复提供研究基础。

1 材料和方法

1.1 材料与设备

供试玉米品种为大丰30。氯化镉CdCl2·2.5H2O（分析纯）购自天津市化学试剂二厂；CP224C 电子天平（奥豪斯仪器有限公司，常州），高速冷冻离心机（Hermle Z-36HK，德国），超纯水机（上海力康生物医疗科技控股有限公司），制冰机（Scotsman，上海），灭菌锅（上海博迅医疗生物仪器股价有限公司），DSQ 单四级杆气相色谱质谱仪（GC-MS，美国Thermo Fisher 公司）。

1.2 试验设计

试验分设单一AR 和AR 与Cd 联合染毒2 个大组，其中，单一AR 染毒组分为5 组，即空白组（CK）、A 组（pH＝5 的酸雨）、B 组（pH＝4 的酸雨）、C 组（pH＝3 的酸雨）、D 组（pH＝2 的酸雨）；AR 与Cd 联合染毒组也分为5 组，即E 组（Cd2+染毒质量分数为 5 mg/kg）、F 组（pH＝5 且 Cd2+染毒质量分数为 5 mg/kg 的酸雨）、G 组（pH＝4 且 Cd2+染毒质量分数为 5 mg/kg 的酸雨）、H 组（pH＝3 且 Cd2+染毒质量分数为 5 mg/kg 的酸雨）、I 组（pH＝2 且 Cd2+染毒质量分数为5 mg/kg 的酸雨）,每组4 盆，每盆种8 粒玉米，每盆土壤质量为180 g。待幼苗发芽率达到75%后[14]，通过定时浇灌喷洒方式完成染毒，染毒量为50 mL，染毒连续14 d，取幼苗进行代谢物的测定。

1.3 代谢物分析

1.3.1 样品前处理 称取液氮研磨后的幼苗60 mg于2 mL EP 中，加入1 mL 甲醇和水混合溶液（体积比为1∶1），超声提取30 min，样品在3 000 r/min条件下离心10 min，取50 μL 上清液于进样小瓶中，在真空冷冻干燥器中吹干。在吹干后的残渣中加入质量浓度为20 g/L 的盐酸甲氧胺吡啶溶液50 μL（含正二十四烷0.1 g/L），37 ℃反应90 min，再加入50 μL N- 甲基 -N-（三甲基硅烷） 三氯乙酰胺（MSTFA）＋1%三甲基氯硅烷（TMMCS）溶液，37 ℃反应 30 min[15]，0.22 μm 有机相膜过滤，待测。

1.3.2 GC-MS 分析条件 用Thermo Fisher DSQ 对待测物进行1.0 μL 不分流进样，接着用DB-5MS 毛细管柱进行色谱分离，进样口温度为280 ℃，载气为氦气，载气流速为1.0 mL/min，柱温初始为80 ℃，保持2 min，接着以10 ℃/min 的升温速率升温至140 ℃，保持 1 min，再以 4 ℃/min 的升温速率升温至240 ℃，保持2 min，最后以5 ℃/min 的升温速率升温至300 ℃，并保持3 min，设溶剂延迟为8 min。质谱仪采用电子碰撞（EI）模式（70 eV）离子化[9]，传输线温度为280 ℃，离子源温度为230 ℃，数据采集扫描模式为全扫描，扫描质核比范围为50～650。

1.4 数据分析

采用SIMCA 14.0 统计软件进行主成分分析（PCA），采用偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）模型和t 检验法对数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同处理下玉米幼苗代谢物的识别

GC-MS 结果分析，对代谢物进行库识别，筛选匹配度大于70%的化合物作为目标代谢物（匹配度表示检索物质与库中标准物质的相似程度，用百分数表示），共筛选出76 种代谢物，再通过筛选质量控制样品中RSD＜30%的代谢物作为后续分析的代谢物，一共49 种。

2.2 不同处理下玉米幼苗差异代谢物的筛选

对AR 单一处理和AR 与Cd 复合胁迫处理的玉米幼苗代谢物进行PCA 分析（图1），t[1]为第1主成分，t[2]为第2 主成分，试验结果显示，AR 单一处理和AR 与Cd 复合胁迫处理后2 个系列表现分离良好，分别为图1中实线圈与虚线圈；不同浓度酸雨的单一处理结果显示，组间分离良好（CK，A，B，C，D 组），不同浓度 AR 与 Cd 复合胁迫处理结果显示，组间亦分离良好（E，F，G，H，I 组），因此，不同浓度的酸雨在单一胁迫和与Cd 复合胁迫均会对玉米幼苗造成不同程度的损伤。

通过OPLS-DA 模型分析，通过变量的载荷大小寻找差异代谢物，载荷越大说明对样本点分类贡献越大。本研究以变量重要性投影（variable import ance in the projection，VIP）＞1.0 和 t 检验（P＜0.05）为差异代谢物选择标准，与CK 组相比，A 组、B 组、C 组和 D 组分别筛选出 11，11，10，11 种差异代谢物（表1）；与 E 组相比，F 组、G 组、H 组和 I 组分别筛选出 10，13，13，9 种差异代谢物（表2）。

表1 酸雨胁迫后玉米幼苗差异代谢物VIP 值

表2 酸雨与镉复合胁迫后玉米幼苗差异代谢物VIP 值

2.3 不同处理下玉米幼苗差异代谢物的变化

2.3.1 氨基酸代谢 AR 单一暴露后，与空白对照组相比，甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、丙氨酸和β-丙氨酸含量显著升高。复合胁迫与同强度AR 单一胁迫相比，玉米幼苗代谢物与AR 单一暴露一致（表3）。

表3 酸雨与镉复合胁迫后玉米幼苗差异代谢物含量 μg/mg

2.3.2 有机酸代谢 AR 单一胁迫时，与空白对照相比，玉米幼苗有机酸代谢物中柠檬酸显著升高；乳酸和苹果酸含量显著降低。复合胁迫与同强度AR 单一胁迫相比，有机酸代谢物变化同AR 单一胁迫一致。总体来看，2 种胁迫对玉米幼苗有机酸含量的影响是一致的（表3）。

2.3.3 糖类代谢 与对照组相比，AR 单一胁迫诱导玉米幼苗中蔗糖和葡萄糖含量随着酸雨pH 值减小而显著上升，AR 与Cd 复合胁迫后玉米幼苗中蔗糖和葡萄糖含量同样随着酸雨pH 值减小而升高，与同强度AR 单一胁迫相比，复合胁迫对玉米幼苗中蔗糖和葡萄糖含量显著升高。总体来看，单一与复合胁迫均诱导玉米幼苗中大部分糖类含量升高，总糖类含量增加（表3）。

2.3.4 抗逆物质代谢 与空白对照相比，AR 单一胁迫对玉米幼苗中抗逆物质腐胺含量的变化显著升高；与同强度AR 单一胁迫相比，复合胁迫对玉米幼苗中抗逆物质含量的变化有腐胺和肌醇，其中，肌醇含量先降后升，是复合胁迫的特有差异代谢物（表3）。

3 讨论

3.1 不同处理对玉米幼苗氨基酸代谢的影响

环境胁迫会对植物体内氨基酸代谢造成影响。甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸和丝氨酸是糖异生的前体氨基酸[16]，在植物体内乙醇酸代谢过程中磷酸乙醇酸被氧化为甘氨酸，然后甘氨酸在线粒体中转化为丝氨酸，丝氨酸在四氢叶酸代谢中至关重要，主要调节-CH3的运输[17]，且丝氨酸的积累是植物老化加速的一个信号[18]。单一和复合胁迫均诱导这2 种氨基酸含量升高，表明玉米幼苗体内蛋白质分解水平增加，糖异生途径水平增高，AR 与Cd 复合胁迫使玉米幼苗光呼吸受到抑制，氨循环受阻。脯氨酸含量在一定程度上可反映植物的抗逆性。胡雁春[19]研究发现，随AR 强度的增大，三叶草脯氨酸含量呈递增趋势；孙盛等[20]研究表明，随Cd 处理浓度的增大，黄瓜幼苗叶片脯氨酸含量增加。这与本研究中AR 单一胁迫、AR 与Cd 复合胁迫均诱导玉米幼苗脯氨酸含量增加的结果一致，表明脯氨酸可抵御Cd 的毒害作用。同时，AR 可诱导植物体内蛋白质溶解酶活性增强，蛋白质分解加快，促使脯氨酸含量升高。

3.2 不同处理对玉米幼苗有机酸代谢的影响

植物在呼吸过程中，通过三羧酸循环（Tricarboxylic acid cycle，TCA）形成一系列有机酸。重金属胁迫下，植物体会分泌大量的草酸、柠檬酸、苹果酸、琥珀酸等有机酸[21]。苹果酸和柠檬酸是植物TCA中2 种重要的有机酸。本研究中，单一胁迫下，苹果酸含量降低而柠檬酸含量升高，说明植株体TCA处于较稳定的状态；复合胁迫下，苹果酸和柠檬酸含量均显著增加，表明复合胁迫阻碍了TCA 的正常运行，玉米幼苗生理情况遭到破坏，TCA 遭到破坏主要是由Cd2+造成的。乳酸累积在细胞内，会使胞质溶胶酸化，影响酶代谢。本研究结果显示，2 种胁迫均诱导乳酸含量降低，且2 种胁迫乳酸含量下降程度相差不大，表明玉米幼苗乳酸含量的降低主要是由酸雨造成的。

3.3 不同处理对玉米幼苗糖类代谢的影响

糖类是植物光合作用和呼吸作用的重要碳化合物，在植物生长发育过程中发挥着重要的作用。在代谢过程中，葡萄糖为植物抗逆提供能量。本研究结果表明，2 种胁迫均诱导玉米幼苗葡萄糖含量增加，启动了糖异生途径中多种氨基酸和有机酸含量的增加，同时，葡萄糖的大量积累提示玉米幼苗的光合作用受到影响[22]。复合胁迫与同强度AR 单一胁迫相比，葡萄糖、蔗糖含量均显著升高，表明Cd2+的存在加大了酸雨对糖类的积累，更大强度地破坏了玉米幼苗的光合作用，抑制其生长，这与KIEFFE 等[23]研究得出的糖类物质的积累是Cd 抑制植物生长的一个重要因素的结果一致。

3.4 不同处理对玉米幼苗抗逆物质的影响

腐胺属于多胺类物质，可增强植物对环境的耐受力[24]。本研究结果显示，2 种胁迫均诱导腐胺含量增加，表明单一胁迫和复合胁迫均会导致玉米幼苗通过调节腐胺的增加来完成对幼苗的自我保护。肌醇在植物体内主要作用是合成细胞壁存储能量[25]，试验结果表明，在复合胁迫下，肌醇含量的升高说明玉米幼苗已经通过自我增加肌醇来对抗恶劣的生长环境。

4 结论

本试验结果表明，2 种胁迫均导致玉米幼苗中氨基酸代谢物发生紊乱，说明机体通过调节氨基酸来对抗逆境；单一胁迫下苹果酸含量降低而柠檬酸含量升高，说明玉米幼苗体内TCA 稳定，复合胁迫下苹果酸和柠檬酸的含量均显著升高，表明复合胁迫可导致玉米幼苗体内TCA 受阻；2 种胁迫均导致糖类化合物的积累，说明酸雨和镉均会导致玉米幼苗的光合作用途径发生紊乱；通过对腐胺、肌醇等抗逆物质的研究可知，2 种胁迫均对玉米幼苗产生了毒性，从而导致抗逆物质积累以抵抗逆境。