紫苏PfPDCT基因序列特征及表达分析

任文燕，周雅莉，杨慧娟，郝月茹，杨宏斌，李润植，王计平

（1.山西农业大学农学院，山西 太谷 030801；2.山西农业大学分子农业与生物能源研究所，山西 太谷 030801）

紫苏（Perilla frutescens L.Britt），又名赤苏、香苏、白苏、桂苏等，属唇形科紫苏属1年生草本植物[1-2]。紫苏资源丰富，遍布我国河北、山西、湖南、广西、海南等20 多个省份，具有特异芳香，是卫生部第一批规定的既是食品又是药品的60 种作物之一[3-4]，在食品医药领域具有重要的开发利用价值，近年来备受人们关注。紫苏种子含油量高达45%，其中，α-亚麻酸（18∶3）含量在种子中占总脂肪酸含量的60%以上，在叶片中占56%[5]。目前，紫苏作为一种新型油料作物被人们广泛接受[6]。

脂肪酸是生物体的基本组成之一，对人体具有重要的生理功能，其中，亚油酸和亚麻酸等不饱和脂肪酸可以促进人体消化吸收、软化血管、防止形成血栓等[7]。BROUN 等[8]和 DAWN 等[9]研究表明，适量摄入不饱和脂肪酸能够降低人体内胆固醇与血脂水平。磷脂酰胆碱甘油二脂转磷酸胆碱酶（PDCT）可以调节不饱和脂肪酸的最终含量，影响种子油中脂肪酸的组成[10]。LU 等[11]研究结果表明，拟南芥中PDCT 基因突变（rod1）能够降低其多不饱和脂肪酸的积累。PDCT 基因在多种植物中的功能已有报道[12-13]，但关于该基因是否参与紫苏种子油中脂肪酸的合成积累过程，目前尚未见报道。

本试验利用生物信息学软件对紫苏PfPDCT 基因结构及编码蛋白的理化性质进行了详细分析，并研究了该基因在晋紫苏1 号种子发育不同时期的表达特性，旨在为今后利用PfPDCT 基因改良油料作物品质及分子育种提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试紫苏品种为晋紫苏1 号，2018年4月种植于山西农业大学试验基地，在紫苏种子不同发育时期（即开花后 10，20，30，40 d）分别取样，液氮速冻后置于-80 ℃冰箱保存备用。

从紫苏油脂代谢机制研究课题组前期测序获得的紫苏转录组数据库中挑选出功能注释为PDCT的基因，根据不同物种间同源基因的核酸序列相对保守的特点，将紫苏中PDCT 基因序列和拟南芥中的同源序列进行比对，获得紫苏PfPDCT 基因全长cDNA 序列。

1.2 试验方法

1.2.1 PDCT 基因结构及理化性质分析 运用ORF Finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）软件分析紫苏PfPDCT 基因的开放阅读框（ORF）；利用ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）软件，根据ORF 分析所得的紫苏PfPDCT 基因的氨基酸序列，进一步分析该基因编码蛋白的基本理化性质；运用TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）软件分析紫苏PfPDCT 蛋白跨膜区域；运用NCBI 的 CDD 工具（http://ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/Wrpsb.cgi）预测紫苏PfPDCT 蛋白质功能结构域；采用 SPOMA（http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl）分析紫苏PfPDCT 蛋白质的二级结构；运用SWISS-Model 工具预测紫苏PfPDCT 蛋白质的三级结构；使用MEGA7 多序列比对软件构建紫苏PfPDCT 基因编码蛋白的系统进化树。

1.2.2 实时荧光定量PCR 采用EASY spin Plus多糖多酚/复杂植物RNA 快速提取试剂盒（北京艾德莱生物科技有限公司）提取紫苏RNA，反转录参考 ABM 公司 5X All-In-One MasterMix（with AccuRT Genomic DNA Removal Kit）反转录成 cDNA。使用Premier 5.0 软件设计紫苏PfPDCT 的qRT-PCR特异引物（表1），参照张玲慧[14]对紫苏内参基因的筛选结果，选择18S rRNA 作为本试验的内参基因，以获得的cDNA 为模板进行实时荧光定量PCR 检测。应用CFX96 Real-Time PCR Detection System 进行扩增，反应体系为：SYBR PremixExTaqⅡ5 μL，PCR Forward Primer 0.3 μL，PCR Reverse Primer 0.3 μL，DNA 模板 0.5 μL，ddH2O 3.9 μL，共 10 μL，3 次重复。反应程序为：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共 40 个循环。相对表达量采用 2-ΔΔCt法进行计算[14]。

表1 引物序列

2 结果与分析

2.1 PfPDCT基因序列结构及编码蛋白的理化性质

通过对转录组测序结果进行比对分析，获得紫苏PfPDCT 基因核酸序列长度共2 098 bp，开放阅读框长度为1 683 bp，共编码560 个氨基酸残基。利用ProtParam 软件对紫苏PfPDCT 基因编码蛋白的理化性质进行分析，其化学分子式为C2782H4299N675O715S21，原子总数为8 492，相对分子质量为59.315 ku，正负电荷残基数分别为30，15 个。脂溶指数为112.43，亲水性系数为0.727，不稳定系数为35.00，推测其为稳定蛋白。

运用TMHMM 软件预测紫苏PfPDCT 蛋白的跨膜结构域，结果表明，第1～12 位氨基酸位于细胞膜内侧，第36～2 098 位氨基酸位于细胞膜外侧，第13～35 位氨基酸为紫苏PfPDCT 蛋白的跨膜区域（图1）。通过分析紫苏PfPDCT 蛋白质的功能结构域，发现该基因所编码的蛋白质属于CitT superfamily 超家族中的成员。

运用SPOMA 软件分析紫苏PfPDCT 蛋白的二级结构，其中，α- 螺旋占41.25%，延伸链占20.18%，β-转角占7.50%，无规则卷曲占31.07%。由此推测，α 螺旋和无规则卷曲是PfPDCT 蛋白二级结构中的主要结构元件，延伸链和β-转角则分散于整个蛋白质中。运用SWISS-Model 软件预测出紫苏PfPDCT 蛋白质的三级结构（图2），由α-螺旋、β 转角、延伸链、无规则卷曲组成，与二级结构预测一致。

在NCBI 上利用BLAST 与其他物种的PDCT基因核苷酸序列进行比对，并利用MEGA7 软件构建紫苏与其他几种植物PDCT 基因的系统发育树，结果表明，紫苏与赤藓的亲缘关系最近（图3）。

2.2 PfPDCT基因表达特性分析

通过实时荧光定量PCR 分析，结果表明，紫苏PfPDCT 基因在不同发育时期的种子中均有表达，其中，在开花后20 d 表达量最高，为开花后10 d 的1.92 倍，该基因高量表达之后进入脂肪酸快速积累期，说明PfPDCT 基因在紫苏种子脂肪酸代谢积累过程发挥了一定作用（图4）。

3 结论与讨论

磷脂酰胆碱甘油二脂转磷酸胆碱酶（PDCT）是影响脂肪酸合成的重要酶，对植物油脂代谢具有一定的调控作用。已有研究表明，PDCT 在发育种子油脂合成过程中主要催化16∶1-PC 与16∶1-DAG的相互转化[15-17]。WICKRAMARATHNA 等[12]将亚麻中克隆到的PDCT 基因转入拟南芥rod1 突变体，可以恢复突变体植株的多不饱和脂肪酸水平。王树彦等[10]研究表明，在胡麻种子成熟期，PDCT 基因表达量与种子油中硬脂酸及亚麻酸含量呈显著正相关，而与亚油酸含量呈显著负相关。HU 等[18]研究表明，PDCT 基因是转基因拟南芥种子中羟化脂肪酸（HFA）有效代谢所必需的。研究表明，PDCT 参与油料作物种子中脂肪酸的合成与代谢过程。

紫苏作为一种新型油料作物，目前，关于其种子油脂代谢机制的研究越来越引起人们的关注。本研究分析了紫苏PfPDCT 基因的结构和功能，并通过qRT-PCR 技术分析了该基因在晋紫苏1 号种子发育不同时期的表达特性，结果表明，紫苏PfPDCT基因全长cDNA 序列为2 098 bp，开放阅读框为1 683 bp，共编码560 个氨基酸残基；该基因所编码的蛋白质属于CitT superfamily 超家族中的成员；系统进化分析表明，紫苏与赤藓的亲缘关系最近；紫苏PfPDCT 基因在不同发育时期的种子中均有表达，且在开花后20 d 表达量最高，为开花后10 d 的1.92 倍；PfPDCT 基因的表达模式与种子发育过程中TAG 积累模式一致，在种子发育中期TAG 快速合成并积累，在种子发育后期TAG 逐渐趋于饱和，合成量降低[19]，进一步证明紫苏PfPDCT 基因参与种子油脂合成积累过程，该研究可为进一步探索紫苏等油料作物的脂肪酸合成代谢机制奠定理论基础。