激素组合等在甘蓝型油菜下胚轴再生中的作用

耿思宇，张姗姗，徐培林，王景雪

（1.山西大学生命科学学院，山西 太原 030006；2.中山大学教育部基因工程重点实验室，广东 广州 510275）

油菜是我国重要的油料作物，其外植体高效再生系统的建立对于油菜的遗传改良、基因功能研究等都具有重要的意义。以往的研究认为，基因型、激素等对外植体的高效再生都具有重要作用。油菜不同品种在外植体再生能力方面存在着明显的基因型依赖性，且多数品种的分化能力并不理想。因此，在油菜基因转化中，针对不同材料优化培养基，建立高效外植体再生系统是进行高效转化的前提。

油菜中外植体的植株再生一般是通过器官发生的方式实现的。在芸苔属中已有用不同外植体如下胚轴[1]、子叶[2]、花茎[3]、叶片[4]、表皮及亚表皮细胞的薄细胞层[5]、根系[6]、花药、小孢子[7-8]、原生质体[9-10]等获得再生植株的报道。植物组织培养涉及因素较多，并且各因素间具有复杂的相互作用，因此，经验的积累尤为重要。前人虽然已对影响植株再生的诸多因素如培养基、基因型[11-13]、不同外植体之间的差异以及所使用植物激素的数量[14]等进行了研究，但是所用的植物激素仅限于少数几种，并且多数是根据所用材料选择高效的植物激素组合，对于不同激素组合的比较研究较少。

对于一个高效的再生体系而言，除了选择最适宜的培养基和外植体外，还必须保证用于组织培养的供试材料处于良好的生理条件。一般来说，来源于温室生长的植株以及在无菌条件下生长的无菌苗是较好的外植体来源。OVESNA 等[15]研究表明，供体植株的年龄也会影响外植体的再生能力。对不同遗传背景材料的植株再生能力的研究表明，不同的遗传背景对植株的再生能力具有一定的影响，Brassica oleracea 基因组最容易再生，而Brassica rapa最难转化[16]。

本试验利用3 种不同的油菜基因型材料，对6-BA，NAA，GA3等植物激素以及 AgNO3在下胚轴植株再生中的作用进行研究，以明确不同激素种类在外植体再生中的作用，并根据所选用材料对不同培养基进行了优化，选出了最佳的培养基，进而建立甘蓝型油菜的高效外植体下胚轴高效再生体系。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试油菜品种为甘蓝型油菜（Brassica napus L.）湘油 14 号、湘油 15 号和 Y03-211，其种子由湖南农业大学油料研究所提供。

供试培养基分为2 种，即诱导油菜再生植株分化培养基（主要成分列于表1）和诱导生根培养基（以附加和不附加植物激素，组成4 种不同的诱导生根培养基，即：RM1.1/2 MS；RM2.MS＋0.2 mg/L NAA；RM3.MS＋0.1 mg/L NAA；RM4.MS＋0.2 mg/L IAA）。

1.2 试验方法

油菜种子用 0.1%（m/V）HgCl2消毒 8 min，无菌水冲洗 5～6 次，置于 MS 固体培养基上，23～25 ℃，16 h/8 h（白天/黑夜）光照条件下发芽，制备成无菌苗。将5～6 d 苗龄的无菌苗下胚轴切成约0.5～1.0 cm 的切段，将下胚轴切段分别置于表1所列的培养基上，以诱导外植体在切口处形成愈伤组织和分化再生芽苗。下胚轴切段接种后，观察不同培养基上外植体开始形成愈伤组织的时间、外植体的出愈率、外植体分化芽苗总数以及外植体上分化正常苗数。试验设3 次重复，每个处理接种的外植体数不小于30 个。

表1 诱导油菜再生植株分化培养基主要成分

2 结果与分析

2.1 激素对再生芽苗诱导的影响

下胚轴外植体接种到各种培养基上后，经1～2 d，大多数外植体在切口处开始膨大；到3～4 d 时，切口处开始出现愈伤组织；到7 d 时，外植体切口处愈伤组织诱导基本完成。愈伤组织开始出现时是松散状的，以后逐渐长成致密状。从表2可以看出，在供试的培养基中，所有材料都能获得80%以上的出愈率。说明这些培养基均可以高效地诱导愈伤组织。

表2 不同基因型、不同激素组合的出愈率 %

大约在外植体接种20 d 后，在致密型愈伤组织上先出现绿色小芽点，继而发育成小芽苗。从表3可以看出，培养基中植物激素对外植体再生芽苗的分化有重要影响。其中，6-BA 对油菜再生植株分化是必需的，3 个品种在无6-BA 的MN 培养基中，虽然都得到了90%以上的出愈率，但均未获得再生苗，说明6-BA 是油菜下胚轴芽苗再生所必需的。对不同激素组合的研究发现，不同基因型对激素组合的要求不同，多数情况下6-BA 与GA3的组合优于6-BA 和NAA 的组合。就3 个基因型平均分化率而言，MBG 培养基的平均分化率（11.56%）大于MBN 培养基（5.81%）；MB3G 培养基的平均分化率（9.58%）大于MB3N 培养基（1.14%）。

表3 不同基因型、不同激素组合的分化率 %

不同基因型最适合的激素组合不尽相同，如湘油15 号、Y03-211 最适合的培养基为MBG，而湘油14 号最适合的培养基组合为MBN。试验发现，在培养基中添加GA3，虽然能够提高再生植株分化率，但是也显著提高了再生植株中玻璃苗的比例。如湘油15 号在MB3A 培养基上，总分化率为26.00%，其中，正常苗分化率为22.29%；而在MB3AG 培养基上，总分化率为56.51%，其中，正常苗分化率为37.94%。即添加GA3后，总分化率增加30.51%，但是正常苗分化率却仅增加了15.65%。

2.2 AgNO3在芽苗分化中的作用

表4 AgNO3对不同基因型、不同激素组合分化率的影响 %

从表4可以看出，几乎在所有的培养基中添加AgNO3都能够显著提高正常芽苗分化率。其中，最为明显的是湘油15 号，其在MBG 培养基上正常芽苗分化率为11.83%，而在MBGA 培养基上正常芽苗分化率为38.29%，较MBG 培养基提高了26.46 百分点；湘油14 号在MB3G 培养基上正常芽苗分化率为7.95%，而在MB3GA 培养基上正常芽苗分化率则为32.05%，较MB3G 培养基提高了24.10 百分点。

通过对16 种含有6-BA 培养基上的不同品种正常芽苗分化率比较发现，供试培养基中，MBGA（MS＋2 mg/L 6-BA＋0.5 mg/L GA3＋20 μmol/L Ag-NO3）培养基最有利于诱导再生植株分化，3 个供试品种的最高正常芽苗分化率（湘油15 号为38.29%；Y03-211 为20.00%；湘油14 号为32.63%）均是在该培养基上得到的（图1）。因此，将MBGA 培养基作为农杆菌转化后再生植株诱导培养基。3 个供试品种下胚轴外植体在MBGA 培养基上再生植株分化情况如图2所示。

2.3 基因型对芽苗分化的影响

从表2，3 可以看出，不同品种再生植株分化能力不同。在培养基成分相同时，3 个供试品种中具有不同的芽苗分化率，说明基因型对芽苗分化具有重要影响。整体来说，湘油14 号再生能力较强，Y03-211 号次之，湘油15 较差。湘油14 号对培养基的适应性要比湘油15 号强一些，但是试验中观察到湘油14 号在供试培养基上再生苗的玻璃化比湘油15 号严重。本试验中还发现，除了培养基成分对玻璃苗的发生有较大影响外，不同品种在是否容易产生玻璃苗上也表现不同。3 个品种中，玻璃苗发生最多的是湘油14 号。分化出的玻璃苗表现为叶片水渍状，叶色是不正常的绿色，叶片发脆易断，不能诱导生根。所以，玻璃苗是无效的分化苗，在组织培养过程中应该尽量减少其生成。

2.4 生根培养基的选择

油菜芽苗再生后，要经过诱导生根才能成为完整的再生植株。因此，生根培养基的诱导效果直接影响转化后抗性芽苗发育成完整的再生植株的概率。一个高效率的生根培养基对提高转化效果十分重要。大约3 cm 长的油菜芽苗移入生根培养基后，10 d 后开始有白色的根状突起出现，之后根状突起发育为不定根；经过30 d 左右的生长，发育为生长良好的根系。

从表5可以看出，油菜生根使用植物生长素NAA 诱导比使用IAA 诱导或不使用植物激素诱导生根效果要好；不同培养基生根率不同，在4 种培养基中，诱导油菜生根效果最好的培养基是MS＋0.2 mg/L NAA，生根率可以达到90%。

表5 不同生根培养基比较

3 结论与讨论

本试验通过不同激素组合培养基的筛选发现，基因型、激素组合以及培养基中AgNO3的添加对再生植株的分化都具有重要影响。培养基中6-BA 对油菜芽苗分化是必要的，当培养基中缺少6-BA时，3 个品种均无芽苗分化。而NAA 对于愈伤组织的形成和芽苗生根非常重要，培养基中增加NAA时，下胚轴的出愈率明显增加，这与前人的研究结果相同[17-18]。已往的研究表明，AgNO3对于包括油菜在内的芸薹属作物的再生植株分化具有显著的促进作用[19-22]。一般认为，AgNO3对芽分化的促进作用是AgNO3抑制了植物组织培养中乙烯的生成。本试验中，AgNO3对于所选用的材料再生植株的高频率分化具有明显的促进作用；NAA 对诱导愈伤组织和芽苗生根具有重要作用。

油菜的芽苗分化是通过器官分化的途径发生的。本研究表明，细胞分裂素6-BA 对诱导外植体的芽苗分化是必需的，6-BA 与GA3的组合优于6-BA与NAA 的组合。在本试验所选用的油菜材料和培养基组成中，MBGA（MS＋2 mg/L 6-BA＋0.5 mg/L GA3＋20 μmol/L AgNO3）培养基最有利于诱导再生植株分化；RM2（MS＋0.2 mg/L NAA）培养基最有利于诱导再生芽苗生根。本研究利用不同的油菜材料建立并完善了高效的外植体再生系统，为建立农杆菌介导的油菜高效遗传转化体系奠定了一定的基础。