7种植物枯萎病病原真菌的鉴定

郑瑞瑞，安 丽，何晓婷，郝晓娟，曹 挥

（山西农业大学农学院，山西 太谷 030801）

植物枯萎病是世界范围内重要的病害威胁之一，主要危害番茄、西瓜、甜瓜等生产。随着瓜果蔬菜保护地的发展以及现代生活对瓜果蔬菜的需求量日益增大，单一品种的长时间种植使枯萎病菌及毒素在土壤内大量积累[1]。枯萎病菌是由镰刀菌引起的土传病害，发病迅速且突然，可危害茄科、兰科、十字花科、葫芦科、芭蕉科等多种作物，引起植物减产、植物萎蔫，在湿润的条件下导致萎蔫、腐烂，一旦发生难以根除，成为制约植物生产的重要影响因素之一[2-4]。

镰刀菌是一种重要的真菌类群，其中包含尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、拟轮枝镰刀菌（Fusarium verticillioides）、三线镰刀菌[5]（Fusarium tricinctum）、燕麦镰刀菌（Fusarium avenaceum）[6]等。镰刀菌的序列活性大，侵入植物及对植物有害的信号多样，使植物的免疫系统难以识别，可以在多个地区、不同植物寄主上发病，使枯萎病的防治愈加困难[7]。镰刀菌属是真菌中最重要的植物病原物和产毒真菌，所产生的毒素是一种蛋白质、脂多糖（HPLP）的复合物[8]。如镰刀菌酸、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON），可堵塞植物导管或者使植物的细胞组织坏死[9]，在人工菌落培养基上的主要表现是菌落颜色为红、黄、紫等色素[10]。

枯萎病病原菌属无性孢子类镰孢菌属（Fusari－um oxysporum Schl.）[11]。枯萎病病原菌的菌丝体和分生孢子梗繁茂，镰刀菌会产生3 种孢子——小型分生孢子、大型分生孢子和厚垣孢子。小型分生孢子为卵圆形至椭圆形，无色，单孢或双孢，单生或串生，一般无隔；大型分生孢子为椭圆形至镰刀形，无色，有3～5 个隔，两端略弯；厚垣孢子是从分生孢子或者老的菌丝体上产生，也会产生拟菌核[12-13]。

尖孢镰刀菌接在PDA 培养基上生长的生物学特征是菌落正面菌丝均为白色，菌丝短绒状，繁殖4～5 代后菌落的颜色变淡，菌丝气生状。菌落背面颜色有白色、浅紫等[14]。

真菌的鉴定主要是形态学鉴定和分子鉴定。形态学鉴定依据真菌菌落颜色、菌丝生长状况、孢子形态、产孢结构及有无横隔的特征进行显微形态分类鉴定[15]。分子鉴定是通过真菌DNA 的一些特异性序列，如核糖体保守序列、致病蛋白及相应真菌的特异性序列等遗传物质来分析每个物种之间内在的遗传变异，鉴定同属、种之间的细小差异，从而对物种的种属进行鉴定[16]。现在镰刀菌常用的分子鉴定的手段有EF-1α 引物[7]、核糖体DNA、线粒体小亚基核糖体、β-微管蛋白及翻译延伸因子等[5]。rDNA 的序列分析广泛应用于真菌各个等级水平的系统学研究，其主要是利用基因间隔序列（Internal transcribed spacer，ITS）[8]引物引出核糖体基因的一段保守序列，多数真菌均可利用这一引物，在一定程度上也减少不同引物的差异性[17]。

本研究主要针对3 个地区、6 种植物上分离得到的镰刀菌进行形态学观察，并结合分子学鉴定明确其属、种，为枯萎真菌病害的鉴定提供理论依据，为今后抑菌试验和抑菌机制的研究提供基础。

1 材料和方法

1.1 材料及仪器试剂

1.1.1 试验材料及试剂 7 种植物枯萎病原菌包括辣椒枯萎菌（2016年7月，山西农业大学农作站）；番茄枯萎菌 1（2018年5月，山西太谷）；番茄枯萎菌2（2016年7月，重庆郊区）；兰花枯萎菌（2016年9月，河南灵宝）；甜瓜枯萎菌（2018年5月，山西太谷）；茄子枯萎菌（2016月7月，山西农业大学农作站）；西瓜枯萎菌（2016年7月，重庆郊区）。马铃薯（PDA，PD）培养基；真菌DNA 快速抽提试剂盒，2×Easy Taq 酶 Mix，Marker（上海生物工程）；琼脂、葡萄糖、无水乙醇（分析纯）等。

1.1.2 主要仪器 压力蒸汽灭菌（G154DWS）、洁净工作台（SW-CJ-2FD），超纯水机（HF Super PWUV），高速台式冷冻离心机（Sorvall ST 16R Centrifuge），BIO-RAD 凝胶成像仪（GelDocXR）。

1.2 试验方法

2018年10月在山西农业大学植物病理实验室进行试验。

1.2.1 真菌的分离与纯化 参照文献[18]进行枯萎病病原真菌的分离与纯化。

1.2.2 真菌的种属鉴定

1.2.2.1 病原菌的形态学鉴定 利用固体培养基玻片法，依据真菌菌落颜色、菌丝生长状况、孢子形态、产孢结构及有无横隔的特征进行显微形态分类鉴定[19]。

1.2.2.2 分子学鉴定 本试验利用rDNA-ITS 引物ITS1—TCCGTAGGTGAACCTGCGG 和 ITS4—TCCT CCGCTTATTGATATGC，进行 PCR 扩增，退火温度为55 ℃，30 个循环，每个循环下降0.5 ℃。1%琼脂糖凝胶电泳110 V，25 min 进行检测，紫外凝胶成像系统观察并拍照，验证DNA 提取及PCR 扩增结果。

2 结果与分析

2.1 不同枯萎病害病原真菌的形态学鉴定

在真菌的识别中，有形态学的识别，诸如菌落的形态、颜色以及在培养基的生长状态，还有孢子的形态，菌丝的形态以及其在培养基上的生长状态，厚垣孢子的形态及大小等。不同植株枯萎菌落形态以及孢子的生长状态如图1所示。

辣椒枯萎菌：菌落背面边缘白色，中间为暗红色，呈放射状生长。菌落正面菌丝致密、白色，绒毛状，边缘为规则放射状，菌落中央下陷。菌丝顶端分叉，生长圆滑，菌丝顶端膨大成分生孢子。大型分生孢子长椭圆短棒状，小型分生孢子短棒状。

番茄枯萎菌1：菌落背面橙黄色，中央颜色较深，呈中央放射状生长，边缘呈包围形。菌落正面菌丝白色，呈绒毛状。菌丝密集程度不一。菌丝顶端膨大脱落形成分生孢子，生长期为椭圆形。大型分生孢子长纺锤形，厚垣孢子产生于分生孢子中，一个分生孢子中有2 个小椭圆状孢子。菌丝多顶端分叉增生，顶端平整或弯钩状，菌丝有隔。

番茄枯萎菌2：菌落背面中央的颜色较深，为紫红色，菌落颜色整体为白色，整体中央放射状生长。菌落边缘卷曲状生长。菌落正面菌丝白色，较密集，蛛网状生长。大型分生孢子镰刀型，有隔（0～3 个），小型分生孢子短棒状。

兰花枯萎菌：菌落背面淡黄色，边缘白色，放射状生长。菌落正面紧密、绒毛状，菌丝白色。菌落形状多不规则，在培养5 代后逐渐规则。菌丝上部分枝为树叉状，分叉短小，顶端膨大圆润或弯钩状。大型分生孢子短棒状，但两端略尖，小型分生孢子椭圆短棒状。

甜瓜枯萎菌：菌落背面淡黄色，菌丝密集、边缘纤细，菌丝粗大，向上凸起生长，毛毡状。菌丝顶端膨大圆滑，分叉短小。菌丝顶端分裂出分生孢子，菌丝有隔。大型分生孢子椭圆形短棒状，小型分生孢子椭圆形短棒状。

茄子枯萎菌：菌落背面深橘黄色，次之橘黄色，外缘浅橘色，呈放射状生长，边缘白色、发散式。菌丝稀疏网格状，边缘絮状。菌丝有隔，分叉多短小，顶端尖细，顶端膨大脱落形成分生孢子，短棒状。大型分生孢子纺锤形，由菌丝的中间细胞分裂产生。小型分生孢子卵圆形或者小纺锤形。

西瓜枯萎菌：菌落背面颜色暗红色，边缘有晕圈，中部出现深色的枝状条纹。菌落正面菌丝致密，呈毛毡状，边缘稀疏，呈放射状。菌丝顶端分叉，弯钩状。厚垣孢子卵圆形。

依据上述的孢子形态以及菌落颜色，确定采集的3 个地区、6 种植物的枯萎病病原菌的均为镰孢属真菌[6]。

2.2 病原真菌的分子学鉴定

利用18S 和28S rDNA 的上下游引物序列，得到7 种不同寄主的枯萎病病原菌菌株的序列结果（表1），并与NCBI Blast 上的已知序列进行比对，确定病原真菌种或亚种。

表1 不同植株枯萎病病原菌ITS 引物鉴定结果

由表1可知，利用rDNA-ITS 鉴定7 种植物枯萎病菌种的种属，结果表明，辣椒枯萎菌、兰花枯萎菌、番茄枯萎菌1 为镰孢属镰刀菌（Fusarium redolens）；番茄枯萎菌2、甜瓜枯萎菌、西瓜枯萎菌为镰孢属尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）；茄子枯萎菌为镰孢属拟轮枝镰刀菌（Fusarium verticillioides）。

3 结论与讨论

本研究从3 个地区、6 种植物枯萎植株进行分离纯化枯萎病原菌，通过形态学观察菌落颜色、分生孢子形状、菌丝生长情况，表明分离纯化的病原菌均为镰孢属真菌。rDNA-ITS 鉴定分离菌种的种属结果表明，辣椒枯萎菌、兰花枯萎菌、番茄枯萎菌1 为镰孢属镰刀菌（Fusarium redolens）；番茄枯萎菌2、甜瓜枯萎菌、西瓜枯萎菌为镰孢属尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）；茄子枯萎菌为镰孢属拟轮枝镰刀菌（Fusarium verticillioides）。

本试验形态学观察结果和分子学鉴定分离纯化的病原菌的属结果相同，均属镰孢属真菌。在形态学鉴定中，病原菌可产生不同颜色的毒素，但是孢子的差异不能鉴定病原菌的种或专化型。利用分子学鉴定可以鉴定至种或者专化型，鉴定出尖孢镰刀菌及拟轮枝镰刀菌。试验结果表明，镰孢属菌株具有多样性，包括镰孢属菌、尖孢镰刀菌、拟轮枝镰刀菌等。枯萎病病原菌生长地区及寄主对枯萎病菌是否为镰孢属没有影响。本试验为之后进行的抑菌试验及抑菌机制的研究提供了基础数据。

在真菌的分离、纯化及回接过程中，因真菌生长条件的改变，会出现毒素分布不均、孢子生长状态不一或不产生、菌丝生长形态变异、厚垣孢子出现困难、分生孢子在形态学上差异小，很难区分多种菌株之间的差异，进而使直接利用形态学鉴定镰孢菌菌种或专化型有困难。而且对菌丝、孢子的描述困难，且对形态观察的显微仪器和拍摄要求极高，容易对试验结果造成错误的鉴定。所以，本试验利用分子学技术rDNA-ITS 辅助鉴定亲缘关系较近的真菌如种、属和属以上真菌。