新塔花水提物对动脉粥样硬化模型小鼠IL-1β和TNF-α水平的影响

张 华， 兰 卫,2， 马学宽， 张选明， 安冬青,2

(1新疆医科大学中医学院， 乌鲁木齐 830011; 2新疆名医名方与特色方剂学实验室， 乌鲁木齐 830000)

新塔花(ZiziphoraclinopodioidesLam.)为唇形科半灌木状植物新塔花的地上部分,在我国主要分布于新疆，内蒙古等地区[1]。新塔花的化学成分主要为挥发油、总黄酮、生物碱、维生素等[2]。Behravan等[3]采用GC和GC-MS法对伊朗产地新塔花挥发油行化学分析，发现其中含有27种成分，主要包括胡薄荷酮(44.5%)、萜品醇(14.5%)等。研究表明，新塔花挥发油中胡薄荷酮具有良好的抗炎作用[4-7]。研究表明新塔花中的总黄酮具有抗氧化性、舒张血管、抗炎止痛的功效[8-9]，临床上多用于治疗失眠多梦、胃肠道和心脑血管疾病的治疗[10-13]。目前关于新塔花治疗动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的研究报道较少，本研究采用HE染色法和酶联免疫吸附法(ELISA)对新塔花防治AS的炎症机制进行研究，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物40只8 w龄雄性ApoE-/-小鼠，10只8 w龄C57小鼠，体质量(19±1)g，C57BL/6J品系，购于北京维通利华公司，许可证号：SCXK(京)2016-0011。饲养于新疆医科大学第一附属医院医学动物实验中心，动物伦理委员会批准，编号：20171129-02。

1.2 仪器BS124S型电子天平(上海精科天平公司)，PM-401型石蜡熔蜡箱日本(SAKURA公司)， LKB-V型切片机(瑞典LKB公司)，5810R型低温高速离心机(德国Eppendrof公司)，DM2500光学显微镜(德国LEICA公司)，Type1500型多功能酶标仪(美国Thermo公司)。

1.3 试药阿托伐他汀(北京Solarbio公司,批号20151223)，HE染色试剂盒(北京Solarbio公司,批号G1120)，小鼠TNF-α ELISA试剂盒(上海酶联生物科技公司,批号ML037211)，小鼠IL-1β ELISA试剂盒(上海酶联生物科技公司,批号ML063132)。新塔花全草(亳州市中正中药材饮片有限公司,批号160801)。

1.4 方法

1.4.1 新塔花水提物的制备 称取芳香新塔花药材2份，每份24 g，粉碎后分别置于圆底烧瓶中，加入200 mL蒸馏水，加热回流提取2 h,过滤，洗涤滤渣，将所得滤液真空旋蒸浓缩， 1份定容至100 mL即得新塔花高剂量溶液(含生药0.18 g/mL)，另一份定容至200 mL即得新塔花低剂量溶液(含生药0.09 g/mL)。

1.4.2 动物模型的建立 将所有小鼠给予高脂饲料喂养1 w，不限饮食饮水，自由活动，建立动脉粥样硬化动物模型。高脂饲料配方：基础饲料82.68%，猪油10%，猪胆盐0.2%，胆固醇2%，蔗糖5%，丙硫氧基嘧啶0.12%，由新疆医科大学动物中心加工而成。

1.4.3 动物的分组及给药 将建模后的ApoE-/-小鼠随机分为模型组(0.4 mL/10 g体质量,蒸馏水)，阿托伐他汀组(3 mg/kg体质量, 阿托伐他汀)，新塔花高剂量组(1.8 g/(kg体质量, 新塔花高剂量溶液)、新塔花低剂量组(0.9 g/kg体质量, 新塔花低剂量溶液)，建模后的C57小鼠为空白组(0.4 mL/10 g体质量,蒸馏水)，每组10只，每天灌胃1次，连续12 w,每周记录小鼠体质量变化，并调整用药量，小鼠实验用药量公式: [g/(kg·d)]=9.1×成人临床常药量[g/(kg·d)]。

1.4.4 标本采集 各组小鼠灌胃12 w末禁食不禁水12 h后，麻醉后眼球取血，置于1.5 mL EP管中，7 500 r/min离心15 min，取上清液，置于-80℃冰箱保存备用；在无菌条件打开小鼠胸腹腔，取主动脉根部至髂肾动脉分支处动脉组织，生理盐水冲洗，胸主动脉用10%甲醛固定，用于HE染色；其余主动脉放置冻存管迅速投入液氮后转-80 ℃冰箱保存。

1.4.5 HE染色 取由甲醛固定的胸主动脉，依次经脱水、透明、浸蜡、包埋后，进行切片，每个组织连续切片5 μm厚度，取6张效果较好的切片；HE染色后在光镜下观察主动脉病理形态变化。

1.4.6 ELISA法测血清中IL-1β和TNF-α水平 采用ELISA技术检测，按照试剂盒操作说明，依次加样、温育、配液洗涤、拍干、加酶、显色、终止等步骤，测定小鼠血清中IL-1β和TNF-α水平。

2 结果

2.1 各组小鼠的一般情况及体质量变化灌胃第12 w末，空白组小鼠对外界刺激反应灵敏，易躁好斗，皮毛光洁，饮食饮水正常，大便干结正常，体质量无变化。与空白组比较，模型组小鼠对外界刺激反应迟钝，喜静少动，皮毛干枯无泽，出现脱落，饮食饮水量减少，大便黏腻，体质量升高，差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较，阿托伐他汀组、新塔花高剂量组小鼠对外界刺激反应迟钝，均表现喜静少动，皮毛干枯无泽，出现脱落，饮食饮水量减少，大便黏腻，体质量升高，差异有统计学意义(P<0.01)；新塔花低剂量组小鼠，对外界刺激反应迟钝，喜静少动，皮毛干枯无泽，出现脱落，饮食饮水量减少，大便黏腻，体质量升高，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.2 小鼠主动脉病理形态学变化小鼠主动脉HE染色表明,空白组小鼠血管壁几乎无脂质沉积，管腔无明显狭窄。模型组小鼠血管壁增厚,出现了脂质沉积和炎症细胞的浸润。新塔花低剂量组小鼠血管壁增厚，内部脂质沉淀和斑块略低于模型组，管腔有狭窄。新塔花高剂量组小鼠AS斑块面积小于模型组，大于空白组。阿托伐他汀组小鼠血管腔狭窄不明显，AS斑块面积小于模型组，血管损伤较小，脂质沉积少，见图1。

表1 各组小鼠体质量变化情况

注：与空白组比较，*P<0.01； 与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。

A:空白组B:模型组C:阿托伐他汀组E:新塔花高剂量组 F:新塔花低剂量组

图1 各组小鼠胸主动脉病理切片图(HE ×100)

2.3 各组小鼠血清TNF-α和IL-1β水平的比较与空白组比较，模型组小鼠血清TNF-ɑ、IL-1β含量升高，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，阿托伐他汀组、新塔花高剂量组小鼠血清TNF-α、IL-1β含量均降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 各组小鼠TNF-α和IL-1β表达水平

注：与空白组比较，*P<0.01； 与模型组比较，#P<0.05,##P<0.01。

3 讨论

动脉粥样硬化是心血管疾病(CVD)的主要病理基础，由AS引起的心血管疾病是一种严重威胁人类，尤其是在中老年人群的常见病，已经成为全球人口死亡的首要原因，具有高患病率、高致残率和高死亡率的特点。截至目前，我国的CVD现患人数约3亿,死亡率居各病因首位,占居民疾病死亡构成的40%以上。AS发病机制复杂多样，包括脂质浸润学说、炎症学说、内皮功能障碍学说等。上世纪末，Ross R首先提出AS炎症学说；2017年 ESC年会公布了CANTOS研究结果证实通过AS抗炎治疗能够有效降低CVD发病率，该研究结果宣告了AS的治疗进入新时代[14-15]。

中医根据AS病变部位和临床表现，大致将其归于“胸痹”、 “眩晕”、“脉痹”等范畴，主要病机为本虚标实。天香丹具有调节血脂水平，改善心肌缺血，抑制炎症反应等功效。新塔花作为其主药，具有抗炎、抗氧化性和心肌保护作用。本研究结果显示,新塔花能够改善小鼠主动脉病理状况，延缓小鼠体质量增加，降低小鼠血清TNF-α和IL-1β含量。提示新塔花水提物具有一定的抗炎效果，但具体是新塔花中的哪些成分起到了抗炎作用尚不明确，仍需进一步的研究证实。