胰蛋白酶和胆汁对细粒棘球绦虫原头蚴外翻和成虫发育的影响

刘文英， 李 军， 王 甜， 郑雪婷， 郭 刚， 张文宝,3

(新疆医科大学1基础医学院， 乌鲁木齐 830011； 2第一附属医院临床医学研究院，3省部共建中亚高发病成因与防治国家重点实验室, 乌鲁木齐 830054)

棘球蚴病(echinococcosis)俗称包虫病，由细粒棘球蚴(Echinococcusgranulosus, E.g)和多房棘球蚴(E.multilocularis, E.m)感染所致，分别称为囊型包虫病(Cystic echinococcosis, CE)和泡型包虫病(Alveolar echinococcosis, AE)分别占棘球蚴病所占病例的95%和5%[1]。棘球绦虫完成生活史需要两种宿主，即中间宿主和终末宿主。终末宿主主要是犬[2-3]。E.g在犬小肠内发育为成虫，感染45 d后发育为带有孕节的成虫释放虫卵，虫卵随粪便排出体外，污染外环境[4]。通过模仿犬体内肠道内环境，体外培养原头蚴向成虫发育，是探索棘球绦虫成虫发育的基础，可以为诊断试剂和疫苗的研发及抗虫药物的筛选提供支持条件[5-6]。原头蚴具有双向发育的特点，即在中间宿主体内可以继发性感染，原头蚴发育为包囊；原头蚴被犬吞食后，在犬的小肠内发育为成虫。双向发育可以在体外培养获得，在无胆汁的培养基中原头蚴向成囊发育，反之则向成虫发育。前期研究发现，原头蚴的外翻和维持对于其向成虫方向发育至关重要[7]。但获得较为一致的外翻原头蚴和体外获取高比例的成虫极为困难，其关键是对影响原头蚴外翻和维持成虫发育的因素不甚了解。本研究参考Smyth等[8-9]推荐的E.g体外培养的传统培养方法，并在此基础上，通过设立不同实验分组，探讨培养基添加胆汁，胰蛋白酶和提前纯水刺激对原头蚴体外培养成虫发育的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器全培养基[RPMI-1640培养基含终浓度为25%的胎牛血清(Gibco)，0.4%酵母(美国Sigma公司)，0.4%葡萄糖(美国Sigma公司)及100 μg/mL双抗(Hyclone公司)]用0.22 μm滤器过滤后备用,20%犬胆汁(新鲜采集于犬，用生理盐水稀释5倍后过滤备用),1%胃蛋白酶(美国Sigma公司，用Hanks液新鲜配置，Hanks液事先用浓HCl调pH值至2.0,10%胰蛋白酶(美国Sigma公司)。培养的设备包括CO2恒温培养箱，倒置显微镜，成像系统，超净工作台，恒温水浴锅和pH计。

1.2 原头蚴的收集和前处理在超净工作台内无菌操作采集细粒棘球绦虫原头蚴，先用磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗3～5遍，沉淀的原头蚴用胃蛋白酶消化，消化方法如下：在50 mL的离心管加入1份体积的沉淀原头蚴和10倍原头蚴沉淀体积的1%胃蛋白酶(pH2.0)，置37℃恒温水浴锅中消化约30 min，每隔5分钟混摇1次。消化好的原头蚴用PBS漂洗5遍后，用含1%双抗的PBS悬浮备用。

1.3 胆盐刺激原头蚴外翻试验经胃蛋白酶消化后的原头蚴用0.1%亚甲基蓝染色，成活率>98%的原头蚴加入96孔培养板中培养，每孔加入200 μL培养基含2 μL原头蚴，分为7个组:A～G组分别含有0、0.005%、0.02%、0.25%、0.5%、1%、5%浓度的犬胆汁，每个实验组设立1个复孔对照。原头蚴的培养条件包括培养温度为38.5℃，5% CO2和100%的湿度，培养箱中连续培养48 h。用倒置显微镜观察。

1.4 胰蛋白酶刺激试验

1.4.1 胰蛋白酶刺激原头蚴 消化后的原头蚴分别加入含终浓度为0.02%犬胆汁和不同终浓度(0%、0.005%、0.01%、0.25%、0.5%、1%、5%)胰蛋白酶的全培养基培养，观察48 h内原头蚴的外翻和死亡率变化。

1.4.2 胰蛋白酶对原头蚴的作用 用含有不同浓度胰蛋白酶的全培养基培养培养原头蚴21 d，每周换液2次，每次换液一半。分为7个组:(1)第1组为全培养基，其中添加终浓度为0.25%的胰蛋白酶和0.02%的犬胆汁，培养3 d后换液逐步去除胰蛋白酶，维持胆汁终浓度为0.02%；(2)第2～4组为全培养基，其中分别添加终浓度为0.01%、0.05%、0.25%的胰蛋白酶并含有0.02%的犬胆汁；(3)第5组为初次添加终浓度为0.25%的胰蛋白酶和0.02%的犬胆汁，培养3 d后换液逐步去除胆汁；(4)第6组为无胰酶含0.02%犬胆汁全培养基；(5)第7组为全培养基无犬胆汁和胰蛋白酶组。每个实验组设立1个复孔对照，观察方式同前。

1.5 纯水刺激试验把消化后的原头蚴放入纯水中，分别刺激0、0.5、3、5、10、15、30及60 min，加入生理盐水终止，用0.1%亚甲基蓝染色1 min，镜下观察低渗透压对原头蚴外翻和虫体死亡的影响，然后根据对原头蚴的不同处理方式，分为3个组：第8组为将消化后原头蚴直接放入含0.25%犬胆汁全培养基中培养；第9组为用纯水刺激30 s后，放入含0.25%犬胆汁全培养基中培养；第10组为直接放入不含犬胆汁全培养基中培养。

2 结果

2.1 胆盐刺激对原头蚴外翻的影响犬胆汁终浓度在0.02%时，48 h培养原头蚴外翻率最高，可达62.7%。当犬胆汁终浓度超过0.25%时，原头蚴外翻率反而出现降低，见图1。

2.2 胰蛋白酶刺激

2.2.1 胰蛋白酶刺激对原头蚴死亡率的影响 当固定全培养基犬胆汁终浓度为0.02%时，胰蛋白酶终浓度低于0.25%，原头蚴培养48 h内，死亡率为0。当胰蛋白酶终浓度为0.5%时，48 h死亡率为13.7%，原头蚴开始出现死亡；胰蛋白酶终浓度为1%时，原头蚴培养48 h后，死亡率为89.5%，对原头蚴杀伤作用明显；胰蛋白酶终浓度为5%时，原头蚴培养12 h后可出现全部死亡。故选取终浓度为0.25%的胰蛋白酶开展后续实验，见图2。

2.2.2 胰蛋白酶对原头蚴体外培养生长发育的影响 在培养第21天，原头蚴外翻率在不同组间差异有统计学意义(F=312.17，P<0.05)，见表1。其中第1组、第2组及第5组原头蚴外翻率最高，可达60%以上。3组间头节外翻率差异无统计学意义，但加胰酶组虫体形态变得细长见图3a，图4。第4组原头蚴外翻率在培养第21天均明显出现下降。第6组在原头蚴培养第21天，绝大部分(>95%)向成囊方向发育，第7组原头蚴培养21 d则几乎都向成囊发育，见图3b，图5。

表1 改变胰蛋白酶浓度对原头蚴后续培养头节外翻的影响

注：体外培养第21天， 与第1组相比，*P<0.05; 与第2组相比，▲P<0.05; 与第3组相比，▼P<0.05; 与第4组相比，●P<0.05; 与第5组相比，★P<0.05。

图3 培养21 d原头蚴的形态变化(×40)

注：箭头所示图a(第1组：成虫性状发育体型细长)，图b(第7组：微囊)

2.3 纯水刺激试验

2.3.1 纯水刺激时间对原头蚴外翻和虫体死亡的影响 低渗水刺激原头蚴3 min后，镜检虫体开始出现肿胀、死亡，且随着时间的延长死亡率逐渐上升，60 min后基本上无存活原头蚴。第1次用低渗水刺激30 s后，原头蚴外翻率达40%以上，与未用水刺激前相比头节外翻率差异具有统计学意义(t=5.34，P=0.013)原头蚴经2次在室温下30 s的刺激，原头蚴外翻率达到100%。因此选择30 s低渗水刺激原头蚴开展后续实验,见图6。

a: Eg(0 d) b: Eg(1 d) c: Eg(7 d) d: Eg(21 d)

图4 第1组不同时间段原头蚴的形态变化(×40)

a: Eg(0 d) b: Eg(1 d) c: Eg(7 d) d: Eg(21 d)

图5 全培养基中原头蚴不同时间段的形态变化(×40)

2.3.2 纯水刺激对原头蚴后续培养头节外翻的影响 在培养开始前5 d，低渗水刺激原头蚴30 s再培养(第8组)头节外翻率高于直接培养组，头节外翻率明显升高，但培养24 h后，外翻原头蚴复原，成虫发育第20天与对照(第9组)无差别(t=0.27，P=0.79)，之后直接培养组原头蚴外翻率迅速上升，培养第30天观察直接培养组头节外翻率已达80%，明显高于低渗水刺激再培养组，差异具有统计学意义(t=5.50，P<0.01)。在无犬胆汁无水刺激培养基组(第10组)，则在第20天已无头节外翻原头蚴，见表2。

表2 纯水刺激原头蚴30 s后再培养头节外翻变化

3 讨论

E. g生活史经历虫卵-六钩蚴-原头蚴-成虫等多个阶段，原头蚴发育阶段是该绦虫生活史的关键环节。原头蚴体外培养受温湿度、培养基成份等多种因素影响。在不含犬胆汁单相培养体系中，含胎牛血清RPMI-1640培养基更适合原头蚴成囊生长，原头蚴在第10天开始向囊发育，在第35～40天可出现肉眼可见的微囊[10]。Zhang等[11]将体外培养发育的微囊继发感染小鼠34周后进行解剖，发现所有小鼠均被成功感染，成囊率可达75%。然而有研究报道在含犬胆汁的双相培养体系中，原头蚴体外培养则会向成虫方向发育，在第17～23天会出现一个节片，25～30 d出现2个节片，37～40 d出现3个节片，50～55 d出现4个节片[12]。本实验原头蚴体外成虫培养21 d出现第1个节片，所得结果与之相同。

原头蚴在终末宿主肠道内向成虫发育受到诸多因素限制，包括胃蛋白酶消化、胆盐、胰蛋白酶以及纯水刺激等。有研究显示，细粒棘球绦虫发育在终末宿主肠道内原头蚴的外翻，成虫的生长，中间宿主肠道内虫卵的孵化和六钩蚴的激活都需要有胆酸盐的参与[13]。本实验发现，犬胆汁终浓度为0.02%较适宜原头蚴的外翻，培养20 d以后原头蚴的外翻仍然维持较好的水平，外翻率可达67%。而无胆汁培养基90%以上的原头蚴发育为包囊。即便前期添加犬胆汁，如果在培养期间去除，原头蚴依然会向成囊方向发育。因此培养过程中维持适量犬胆汁浓度对原头蚴的成虫发育必不可少。

有研究发现，用0.25%胰蛋白酶对原头蚴虫体会产生消化作用，原头蚴对胰蛋白酶终浓度>0.5%的培养基耐受性较差[14]。本研究发现，胰酶并不能提高原头蚴的外翻，但是低浓度的胰酶浓度有利于原头蚴的成虫性状发育。有关胰酶与原头蚴发育关系的研究较少，这是今后需要继续关注的一个方面。

本研究发现，纯水刺激原头蚴30 s会明显提高其头节外翻率且不会发生死亡，这可能与原头蚴对低渗透压环境较为敏感，大量原头蚴受到刺激后短时间内发生头节外翻有关。但随着培养时间的延长，发现培养前30 s的纯水刺激不能促进原头蚴的头节外翻。甚至培养到第30天左右反而出现无纯水刺激的原头蚴外翻率维持水平更高的现象，当然这还需要做重复实验进一步加以确认。

本研究观察到的胆盐，胰蛋白酶和纯水对E. g原头蚴生长发育产生的作用，其机制还有待于进一步利用转录组学和蛋白组学等研究手段来加以阐明。