高分辨率熔解曲线对痰液中结核分枝杆菌耐药性分析

姚 欣， 黎彧利， 朱艮苗

(重庆市巴南区人民医院检验科， 重庆 401320)

结核病( Tuberculosis，TB) 是对人类健康最具威胁性和挑战性的感染性疾病之一，是各国关注的严重公共卫生问题[1]。世界卫生组织称，2015年全世界报告了1 040万新结核病例[2]。随着治疗药物的应用，结核分枝杆菌出现耐药性的现象越来越多，其获得耐药性有2个主要因素：一为获得性基因突变，二为外排泵的激活。常见的结核耐药相关基因有利福平相关(rpoB)、异烟肼相关(katG、inhA)、乙胺丁醇相关(embABC)、吡嗪酰胺相关(pncA)、链霉素相关(rpsL、rrs)、氟喹诺酮相关(gyrA、gyrB)。检测方法主要有 Xpert MTB/RIF 检测系统、探针杂交技术和高分辨率熔解曲线技术等[3]。本研究利用高分辨率熔解曲线(HRM)技术分析结核病患者耐药性，旨在为获得更准确更快速的临床检验报告提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 标本采集选取2017年1月-2018年6月重庆市巴南区人民医院确诊为肺结核病的患者痰样本250份。患者平均年龄为(52.4±14.2)岁，其中男性185例，女性65例，所有患者均为初治。按照临床检验操作规程留取合格痰标本。

1.2 涂片镜检根据人民卫生出版社第5版《临床微生物学检验》[4]规定在100个观察视野中存在1～9个分枝杆菌为1+；10个观察视野中存在1～9个分枝杆菌为2+；每个观察视野中存在1～9个分枝杆菌为3+；每个观察视野中存在>9个分枝杆菌为4+。

1.3 细菌培养将痰标本用4% NaOH处理20～30 min，以去除杂菌。将处理后的标本接种于罗琴培养基，置37℃、5%CO2培养箱中培养8周，观察出现典型灰白色颗粒状、干燥的菌落且抗酸染色为阳性者为培养成功。

1.4 细菌耐药性从固体培养基上的分枝杆菌中分离菌株，在肉汤中进行接种，并在37℃下孵育7 d。细菌生长后，在盐水吐温-80溶液中制备稀释液，并用Middlebrook 7H10培养基铺板，在37℃下培养21 d。异烟肼(INH)使用0.2 μg/ mL和1.0 μg/mL的浓度，利福平(RIF)使用1.0 μg/mL的浓度。通过计数对照板(H37Rv)上的菌落对含有药物的平板进行平板读数。耐药百分比 =(含药培养基上生长的菌落数)/(对照培养基上生长的菌落数)×50%。若耐药百分比≥1%，则认为受试菌对该药耐药(R)，<1%判断为敏感(S)。

1.6 熔解曲线分析引物序列如表1所示。在以下条件进行实时PCR(Rotor Gene Q，德国 QIAGEN 公司)：95℃变性10 min，95℃1 min，55℃30 s，72℃ 1 min，共40个循环，最后在72℃下延伸7 min。高分辨率熔解曲线分析在55℃～85℃的温度范围进行，增量为0.02℃。将H37Rv菌株的DNA用作参照，并在实时PCR后分析解链曲线，以鉴定与rpoB、katG和inhA启动子区域基因中的RIF和INH抗性相关的突变区域。具有与H37Rv类似的分化曲线谱的痰样品被认为对特定药物敏感。相反，具有除H37Rv之外的分化曲线谱的痰样品被认为对特定药物具有抗性。

表1 引物序列

1.7 统计学分析应用SPSS21.0软件对数据进行统计学分析,评估熔解曲线分析的灵敏度、特异性、阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)并制成四格表。

2 结果

2.1 表型特征及耐药性根据涂片镜检的分枝杆菌数量，将样本分为4类：1+21份，2+72份，3+76份，4+81份，单药耐药和多药耐药性结果见表2。

表2 表型特征及耐药性/例

注：MDR为多药耐药。

2.2 耐药熔解曲线分析在具有已知表型谱的250个痰标本中，发现99个图谱与对照有差异，为RIF耐药，101个图谱与对照有差异，为INH耐药。观察到的分化曲线具有敏感和耐药部分(图1)。

2.3 熔解曲线与琼脂平板对耐药性分析结果高分辨率熔解曲线分析发现对RIF耐药99例，INH耐药101例，MDR 89例。药敏试验结果显示RIF耐药93例，INH耐药102例，MDR 69例(表3)。高分辨率熔解曲线诊断RIF耐药、INH耐药和MDR耐药的灵敏度分别为90.3%、90.2%、89.9%，特异性为90.4%、93.9%、90.6%。

表3 熔解曲线与琼脂平板对耐药性分析/例

注：R：耐药；S：敏感；HRM：高分辨率熔解曲线；RIF：利福平；INH：异烟肼；MDR：多重耐药。

2.4 涂片结果与HRM分析多重耐药性的关系根据涂片镜检的结果将涂片分级，分级后的HRM对多重耐药性的诊断灵敏度、特异性、PPV、NPV结果见表4。对于涂片为4+的标本，HRM诊断的灵敏度、特异性、PPV和NPV均最高，而1+最低，说明细菌数量越多，HRM诊断多重耐药性越可靠。

表4 MDR检测的熔解曲线和琼脂平板比例分析中的诊断参数

注：HRM为高分辨率熔解曲线，APP为琼脂平板。

3 讨论

本研究利用高分辨率熔解曲线检测痰液中结核分枝杆菌的耐药性,结果显示，对于单药RIF或INH的耐药性分析的灵敏度和特异性均高于90%，而对于多重耐药性的诊断则此参数稍有下降。可能原因是对于单个药物的耐药性分析时，高分辨率熔解曲线有明确的对照比较，通过图谱清晰区分耐药个体，而其中有假阳性或假阴性的存在，所以在预测多重耐药性时，假阴性和假阳性的叠加，使得多重耐药MDR型诊断的灵敏度和特异性比单独基因型低。由本研究结果可知，多重耐药MDR型的灵敏度与特异性分别为89.9%和90.6%，因此对于多重耐药性的诊断也具有一定的可靠性和实用性。

本研究观察到不同涂片的结果与其HRM分析的灵敏度、特异性、PPV和NPV也有所不同。与涂片1+、2+和3+相比，4+样本的敏感性和特异性更高。杨彩虹等[5]研究结果显示，高分辨率溶解曲线用于结核分枝杆菌对异烟肼耐药性的检测具有较好的灵敏度，耗时短，在异烟肼耐药结核病的快速诊断方面具有一定的应用价值，与本研究结果基本一致。本研究在此基础上，进一步细化了对于不同涂片结果，高分辨率熔解曲线诊断耐药性的灵敏度与特异性等。对于涂片结果菌数较多的标本，利用高分辨率熔解曲线可以快速准确地确定耐药结果，从而提高诊断效率；对于涂片菌数较少的标本，不建议将高分辨率熔解曲线分析做首选，应以传统药敏试验为主，而高分辨率熔解曲线可作为辅助诊断。基于rpoB、katG基因和inhA启动子区域进行高分辨率熔解曲线分析诊断结核杆菌多重耐药性可作为筛选试验。

在国内外已经使用商业试剂盒基因型MTBDRplus的分子方法，其结合了常规多重PCR和硝酸纤维条带中的反向杂交，但该方法复杂[6]。在分子方法中，其他方法的成本较高，因此熔解曲线的分析是诊断的理想选择。 通过实时PCR在痰样品中进行MDR-TB，不但可以在24 h内进行实验结果回报并且成本低廉，结果也易于解释。

Galarza等[7]研究显示，MDR-TB检测灵敏度和特异性大于90%，并发现与rpoB、katG和inhA基因相关的最常见突变是S531L、S315T1和C-15T。Tavakkoliamol等[8]通过熔解曲线分析了2 000份阳性痰标本，发现点突变检测灵敏度为98.6%，特异性为100.0%，与本研究结果相似。 Anthwal等[9]分析了124份痰标本，在基因rpoB、katG和启动子区域inhA其敏感度分别为89.0%、85.0%、100.0%，所有基因的特异性均为100.0%。

DNA质量影响敏感性和耐药性熔解曲线的区分。 与传统方法(例如样品煮沸或基于树脂的纯化)相比，用商业试剂盒纯化DNA能够充分地区分敏感性和耐药性2种熔解曲线[10-13]。此外，从痰液样品中提取的DNA，往往包含结核分枝杆菌以及人体中的DNA，因此有必要对DNA进行优化。

总之，熔解曲线的分析对痰标本中MDR-TB的快速诊断具有较高的灵敏性和特异性，能够基于特定基因鉴定抗药性突变。使用该方法作为结核病耐药型诊断的附加筛查试验，成本低、易于解释，且需要较少的诊断时间。