杭州市西湖景区春季空气细菌多样性特征

楼秀芹,郭卫俊,姚文冲,方治国,*

1 杭州市疾病预防控制中心微生物检验科,杭州 310021 2 浙江工商大学环境科学与工程学院,杭州 310018

生物气溶胶是指具有生命的气溶胶粒子(包括细菌、真菌、病毒等微生物粒子)和活性粒子(花粉、孢子等)以及由有生命活性的机体所释放到空气中各种粒子的统称[1- 2]。空气中的微生物是大气生物气溶胶的主要组成部分,其不仅具有重要的生态系统功能,影响着全球气候变化[3- 6],还与空气质量和人类健康密切相关。一方面,由生物粒子组成的气溶胶,可间接作为云凝结核和冰核,导致云滴和冰晶的形成,在雨雪的形成过程中发挥着非常重要的功能,并且可通过直接散射或吸收太阳能辐射在全球气候变化中起着至关重要的作用[5-9]；另一方面,作为空气污染表征体系的一部分,生物气溶胶对评价空气污染的致病性和过敏性具有重要的作用,小部分具有活性的生物气溶胶能够导致各种微生物疾病发生[10]。

空气细菌是空气中微生物的重要组成部分,所有细菌气溶胶都是通过自然界进入空气中的。空气中细菌的存在和分布是以人类为中心的[11],因此空气细菌主要来源于自然界的土壤、动植物和人类,所有的水体界面包括湖泊、海洋、河流等也是空气细菌的来源之一,另外一些非自然的活动如污水处理、动物饲养、发酵过程和农业活动等也是其重要来源[12- 15]。空气中细菌的存在与人类健康有着密切的联系,它们能够向周围的环境扩散,导致人类过敏反应,对免疫力低下的人们造成严重的健康危害[16]；容易造成人群传染病爆发流行；污染食品,造成人们食物中毒；使医药品、化妆品等日常用品变质；并且能够腐蚀用于基础建设的金属材料及用于科研生产的精密仪器,造成重大的经济损失[17-19]。

杭州是浙江省省会和经济、文化科教中心,长江三角洲中心城市之一,国家历史文化名城和南方典型的风景旅游城市,而且杭州市被确定为2016年G20峰会的主办城市,这更有助于显著提升杭州市的国际地位和形象。西湖景区是杭州的地标性旅游景区,世界文化遗产,国家5A级旅游景区,中国首批国家重点风景名胜区,首批全国文明风景旅游区示范点,中国十大名胜古迹之一,中国主要的观赏性淡水湖泊之一,在中国的历史文化和风景名胜中占有重要地位。“杭州西湖文化景观”于2011年正式被列入《世界遗产名录》,成为世界文化景观的杰出典范。作为世界闻名的旅游胜地,杭州西湖景区每年的游客接待量持续位居全国前列,来杭旅游人数不断增加,2015年中外游客的接待量已经突破1.2亿人次。2016年十一黄金周期间杭州共接待游客1578万人次,其中西湖风景区接待游客就超过了437万人次,显著超出了杭州的旅游负载量。随着杭州在国内外的知名度明显提高,城市的人流量和车流量显著增加,因此杭州西湖景区空气生物性污染问题也日益突出。然而,有关杭州市西湖景区空气微生物的研究工作至今鲜有任何报道。论文选取了杭州市西湖景区4个典型景点作为样点,通过高通量测序研究了空气细菌多样性特征,可为控制西湖景区空气生物性污染和相关管理部门制定环境政策法规提供理论指导和参考依据。

1 研究材料与方法

1.1 研究样点概况

杭州西湖景区位于浙江省杭州市西面,景区内群山高度都不超过400米,环布在西湖的南、西、北三面,景区总面积达49 km2,其中湖面6.5 km2。景区以植物造景为主,由大量乔灌木组成疏落有致、大小不同的空间。2007年5月8日经国家旅游局正式批准为国家AAAAA级旅游景区,2011年6月24日“中国杭州西湖文化景观”正式被列入《世界遗产名录》。选取西湖景区具有代表性且具有不同特征的4个景点作为研究样点,分别为柳浪闻莺(Orioles singing in the willow-OSW)、三潭印月(Three pools mirroring the moon-TPMM)、断桥残雪(Melting snow at broken bridge-MSBB)和宝石流霞(Precious stone hill floating in rosy clouds-PSHFRC)。柳浪闻莺(OSW)位于西湖东南岸,园内垂柳林立,遍及紫楠、雪松、广玉兰和梅花等。断桥残雪(MSBB)位于西湖白堤东端,是西湖景区人流量最大的景点之一。三潭印月(TPMM)是西湖中最大的岛屿,风景秀丽、景色清幽,绿树掩映、花木扶疏,湖岸垂柳拂波。宝石流霞(PSHFRC)位于西湖北岸自成一体的葛岭和宝石山,保俶塔巍然挺秀,景色奇特。

1.2 空气微生物取样器

采用法国Bertin* Coriolis μ 空气生物采样器进行取样,Coriolis μ采用全新的气旋式采样技术,空气流速最高可达300 L/min。Coriolis μ能够高效收集空气中的生物样品,样品的采集形式为液体样品,样品后续处理高度灵活,样品可进行稀释和浓缩,以获得更大范围更精确的生物样品信息,用于包括琼脂平板培养在内的多种检测技术。

1.3 取样方法

在杭州市西湖景区选定4个样点(OSW、MSBB、TPMM、PSHFRC),于2016年5月选择相同的天气条件(晴),利用Coriolius μ空气微生物液体采样器进行取样,取样时空气温度为25℃,风向为东风,风速≤3级。利用Coriolius μ空气微生物液体采样器进行取样,每个样点3个重复。取样高度距离地面约1.5 m处,空气流速250 L/min,取样时间为2 h。取样时收集管初始取样液为12 mL,为了保证收集管里液体量的稳定,每隔10 min往收集管里加少许收集液,取样结束后将样本带回实验室,然后进行DNA提取,收集的样本用于空气中细菌多样性特征研究。

1.4 液体样品的浓缩与DNA提取方法

利用Coriolius μ空气微生物液体采样器收集的样本通过高速离心和浓缩过滤管过滤后收集约100 μL的原液混合物,然后转移至1.5 mL离心管中,将浓缩后的样本利用QIAamp DNA Mini Kit(50)试剂盒提取空气细菌基因组DNA,将检测合格的细菌基因组DNA样本送至上海祥音生物科技有限公司进行搞通量测序。

1.5 空气细菌高通量测序

以样品DNA作为PCR反应模板,扩增16S rRNA基因的V3—V4区。PCR反应正反向引物分别为5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG- 3′和5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT- 3′,扩增后得到425 bp的扩增片段,检测合格后,添加测序接头,选用Miseq PE300平台实施双末端测序。

1.6 数据处理

1.6.1质量控制

Hiseq双端测序原始序列3′端可能带有adaptor接头序列,以及一些少量低质量序列和杂质序列。利用cutadapt软件(Version 1.16)去除3′端测序接头,利用Pandaseq软件(Version 2.9)根据双端测序序列的重叠关系将成对的reads拼接成一条序列,得到高变区的原始序列(raw read)。对拼接后的序列进行质控分析(去除尾部质量值低于20以下碱基和含N碱基部分序列的reads)获得有效序列(clean reads)。

1.6.2OTUs与多样性分析

将拼接的有效序列中的singletons过滤掉,利用Uparse(Version 7.0.1001)去除嵌合体,并在97%的相似度下对序列进行聚类,得到用于物种分类的OTUs。在保证测序深度足够的前提下,对每个样本进行归一化处理。然后,对抽平后的序列聚类的OTUs进行微生物分析和主成分(PCA)分析。

1.6.3群落结构组成和相似性分析

从OTUs中挑选出丰富度最高的一条序列作为代表序列,与16S rDNA数据库(Greengenes)在97%的相似性下进行比对,从而对OTUs进行物种注释,并根据每个OUT中序列的条数得到OUT分布表,对物种丰度和热图进行分析。利用QIIME软件(Version 1.9.0)计算Alpha多样性和Beta多样性指数。

2 研究结果

2.1 空气细菌OUT及α多样性分析

采集的空气细菌样品,经DNA提取、检测和高通量测序后,将所得原始数据进行拼接、质控和去除嵌合体,共得到252325条序列。通过分析总共获得OTU数量为17795,其中OSW的OTU数量为3771,TPMM为4261,MSBB为5075,PSHFRC为4688。从OTU研究结果中可知,西湖景区不同样点空气细菌群落丰富度差异显著,OSW空气中细菌丰度最小,而MSBB空气中细菌丰度较大。

表1是不同样点α多样性指数,MSBB的香农指数、ACE指数、Chao1指数、Coverage指数、Simpson指数分别为6.07、20673、13072、0.95、0.0123,而PSHFRC的上述指数分别为5.43、21790、12401、0.95、0.0371。与其他样点相比,MSBB空气中细菌丰富度较高,均匀度较低,而PSHFRC空气中细菌丰富度较低,均匀度较高。

表1 杭州市西湖景区不同样点空气细菌样品Alpha多样性指数

MSBB：断桥残雪,melting snow at broken bridge；OSW：柳浪闻莺,orioles singing in the willow；PSHFRC：宝石流霞,precious stone hill floating in rosy clouds；TPMM：三潭印月,three pools mirroring the moon

2.2 空气细菌群落结构组成分析

各样点细菌相对含量最多的均为变形菌门(Proteobacteria),分别是MSBB占54.54%,OSW占53.49%,PSHFRC占60.15%,TPMM占56.97%,其在4个样点中的平均相对含量为56.29%；其次为放线菌门(Actinobacteria),分别是MSBB占19.37%、OSW占16.03%、TPMM占15.23%、PSHFRC占11.73%,其在4个样点中的平均相对含量为15.59%。细菌门分类水平上,OSW和TPMM相对含量第三的是厚壁菌门(Firmicutes),分别占9.65%和11.6%,第四的是拟杆菌门(Bacteroidetes),分别占6.86%和5.55%；MSBB和PSHFRC与之相反,相对含量第三的是拟杆菌门,分别占7.31%和7.86%,第四是厚壁菌门,分别占7.09%和5.32%。从以上的研究结果可以得出,西湖景区各样点空气细菌在门水平上相对含量较多的为变形菌门、放线菌门、厚壁菌门和拟杆菌门,这4门细菌总的相对含量在各样点分布特征为MSBB占88.31%,OSW占86.03%,PSHFRC占85.06%,TPMM占89.28%(图1)。

图1 门分类水平西湖景区不同样点空气细菌的相对丰度 Fig.1 Relative abundance of airborne bacteria in the level of phylum classification at different sampling sites in West Lake scenic areasMSBB断桥残雪：melting snow at broken bridge；OSW：柳浪闻莺,orioles singing in the willow；PSHFRC：宝石流霞,precious stone hill floating in rosy clouds；TPMM：三潭印月,three pools mirroring the moon

杭州市西湖景区各样点空气中共有细菌954属,其中MSBB的优势菌群依次为马赛菌属(Massilia)(6.22%)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)(3.61%)、甲基杆菌属(Methylobacterium) (3.53%)、副球菌属(Paracoccus)(3.16%)、刘志恒菌属(Zhihengliuella)(2.6%)、薄层菌属(Hymenobacter) (2.22%)、异常球菌属(Deinococcus)(2.21%)；TPMM的优势菌群依次为两面神菌属(Janibacter)(6.45%)、甲基杆菌属(5.44%)、马赛菌属(4.99%)、芽孢杆菌属(Bacillus) (3.36%)、鞘氨醇单胞菌属(2.9%)、异常球菌属(2.51%)、微红微球菌属(Rubellimicrobium) (2.19%)；OSW相对含量较多的菌群为鞘氨醇单胞菌属(6.05%)、两面神菌属(3.91%)、异常球菌属(3.29%)、马赛菌属(3.15%)、食酸菌属(Acidovorax)(3.01%)、副球菌属(2.98%)、甲基杆菌属(2.54%)；PSHFRC的优势菌群则依次为甲基杆菌属(11.5%)、鞘氨醇单胞菌属(11.21%)、异常球菌属(4.74%)、薄层菌属(3.72%)、微红微球菌(2.83%)、食酸菌属(2.06%)。从以上研究结果可以得出,MSBB样点马赛菌属相对含量显著高于其他菌属,而PSHFRC样点马赛菌属相对含量为0.93%；OSW样点鞘氨醇单胞菌属显著高于其他菌属,而TPMM样点鞘氨醇单胞菌属相对含量为2.9%；PSHFRC样点则甲基杆菌属和鞘氨醇单胞菌属显著高于其他菌属,而OSW样点甲基杆菌属相对含量为2.54%；TPMM样点两面神菌属显著高于其他菌属,而PSHFRC样点两面神菌属相对含量为0(图2)。因此,西湖景区各样点不同细菌在属水平上相对含量差异非常显著。此外,各样点相对含量在2%以上的细菌属主要有鞘氨醇单胞菌属、甲基杆菌属、薄层菌属和异常球菌属,这些菌属是西湖景区不同样点共有的优势菌群。

图2 属分类水平西湖景区不同样点空气细菌的相对丰度Fig.2 Relative abundance of airborne bacteria in the level of genus classification at different sampling sites in West Lake scenic areas

2.3 不同样点空气细菌群落结构相似性分析

从属分类水平挑选丰富度最高的前40个物种作物种丰富热图,从图中可以看出,西湖景区各个样点空气细菌群群落差异显著(图3),从不同样点空气细菌样品主成分分析来看,能够得到一致的结果。西湖景区空气中优势细菌属为鞘氨醇单胞菌属、甲基杆菌属、马赛菌属、异常球菌属、薄层菌属和两面神菌属。两面神菌属相对丰度在各样点OSW(3.91%)、TPMM(6.45%)与MSBB(0.03%)、PSHFRC(0)差异非常显著；芽孢杆菌属相对丰度在各样点TPMM(3.36%)与MSBB(0)、OSW(0.31%)、PSHFRC(0.22%)差异显著；马赛菌属相对丰度在样点TPMM(4.99%)、MSBB(6.22%)、OSW(3.15%)与PSHFRC(0.93%)差异显著(图4)。

图3 属水平西湖景区不同样点空气细菌样品物种丰度热图Fig.3 Species abundance heatmap of airborne bacteria in the level of genus at different sampling sites in West Lake scenic area

3 讨论

在杭州市西湖景区选取了4个典型样点,系统研究了西湖景区空气细菌群落特征。在细菌门水平上,各样点优势细菌门均为变形菌门、放线菌门、厚壁菌门和拟杆菌门,其总相对含量在MSBB、OSW、PSHFRC和TPMM分别为88.31%、86.03%、85.06%和89.28%,不同样点空气细菌门水平上存在一定的差异,OSW和TPMM厚壁菌门分别占9.65%和11.6%,拟杆菌门分别占6.86%和5.55%,MSBB和PSHFRC拟杆菌门分别占7.31%和7.86%,厚壁菌门分别占7.09%和5.32%。在细菌属水平上,各样点优势细菌属及含量差异显著,MSBB、TPMM、OSW和PSHFRC含量最大的优势菌属分别为马赛菌属、两面神菌属、鞘氨醇单胞菌属和甲基杆菌属,分别占6.22%、6.45%、6.05%和11.5%,各样点相对含量均高于2%的菌属有鞘氨醇单胞菌属、甲基杆菌属、薄层菌属和异常球菌属,这些菌属是西湖景区共有的优势菌群。姚文冲等研究了杭州市不同功能区空气细菌群落特征,空气中以变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、蓝细菌门(Cyanobacteria)和放线菌门为优势菌群,但不同功能区及不同季节其丰度存在显著差异,且优势细菌属与西湖景区显著不同[20]；张旭等研究了浙江大学紫金港校农业生命环境大楼空气细菌群落组成,空气中颗粒物样品上以变形菌门(24.63%—54.22%)、蓝细菌门(6.10%—20.27%)、厚壁菌门(9.91%—29.76%)、放线菌门(9.27%—18.87%)和拟杆菌门(7.52%—24.29)为主,累计丰度约达90%。西湖景区和上述研究的样点均在杭州,但由于样点周边环境显著不同,空气中优势细菌门存在一定的差异,在西湖景区蓝细菌门丰度较低,而在浙江大学紫金港校区蓝细菌门丰度较高,而西湖景区优势菌属与杭州不同功能区差异显著[21]。王丹丹等研究了塔克拉玛干沙尘暴源区空气细菌群落多样性,发现其空气中细菌主要有4门37 属,优势菌群为变形菌门、拟杆菌门、放线菌门和厚壁菌门,分别占67.6%、17.6%、11.7%和2.9%,优势菌属为微杆菌属(Microbacterium)、不动杆菌属(Acinetobacter)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、柄杆菌属(Caulobacter)、叶杆菌属(Phyllobacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、海洋杆菌属(Pontibacter)和根瘤菌属(Rhizobium)。在门的水平上,西湖景区空气细菌特征与塔克拉玛干沙尘暴源区基本相似；在属水平上,两地空气细菌群落差异显著,其优势菌群明显不同,这可能是由于两地显著不同的环境特征而引起的[22]。凌琪等利用可培养法研究了黄山风景区空气细菌特征,经鉴定得出优势菌属依次为芽孢杆菌属、葡萄球菌属(Staphylococcus)、微球菌属(Micrococcus)和假单胞菌属,分别占总细菌的37.7%、17.2%、10.1%、9.8%[23],这与本研究中空气细菌群落结构差异显著。一方面,由于环境中绝大多数细菌是不可培养的,而可培养的细菌只占总数的0.1%—10%,在营养贫瘠的空气中比例可能更低[24],这就导致了利用培养法和非培养法研究空气中细菌群落的显著差异[25]；另一方面,黄山风景区和西湖景区两地的环境特征不同,黄山风景区海拔较高,西湖景区具有较大的水域面积,虽然两地的植被覆盖率较高,但植被类型显著不同,这些也是导致西湖景区和黄山风景区空气中细菌种类不同的原因。

从OTU和多样性指数分析来看,与其他样点相比,MSBB空气中细菌丰富度较高,均匀度较低,而PSHFRC空气中细菌丰富度较低,均匀度较高。研究表明,人员流动、车辆活动和绿化植被是影响空气中细菌特征的最重要因素,空气中细菌种类和含量与地面扰动有着显著的关系[17- 19,26]。MSBB是西湖景区游客流量最大的景点之一,一方面,人员频繁活动容易使得地面的尘埃粒子漂浮在空气中形成飘尘,使得周边环境中细菌的丰度都显著增加；另一方面,人流量较多的地方,皮肤表面所携带的细菌可能会释放到空气中,且人们也可通过喷嚏等形式把大量的细菌释放到空气中,使得周边环境中病原性细菌的种类和含量明显增加。这些因素也是引起MSBB空气中细菌均匀度较低的重要原因。OSW是西湖景区植被覆盖及绿化最好的景点之一,空气湿润,较为阴凉,绿地对空气细菌有明显的滤除作用,总体环境不利于空气中细菌的生长和繁殖[27],并且不同种类植物的挥发性分泌物对空气细菌有显著的灭杀作用[28-30],使得OSW空气中病原性细菌种类较少。PSHFRC是位于西湖北岸的葛岭和宝石山上,海拔明显高于其他样点,且游客数量显著低于其他景点,这就导致了其空气细菌丰富度较低和均匀度较高。

图4 西湖景区不同样点空气细菌样品主成分分析 Fig.4 PCA analysis of airborne bacteria at different sampling sites in West Lake scenic area

4 结论

杭州市西湖景区不同景点空气细菌多样性特征差异显著,各景点丰富度和均匀度明显不同,MSBB空气细菌丰富度较高,均匀度较低,而PSHFRC丰富度较低,均匀度较高。在细菌门水平上,各景点优势细菌为变形菌门、放线菌门、厚壁菌门和拟杆菌门,但不同景点空气细菌群落及含量存在一定的差异；在细菌属水平上,MSBB、TPMM、OSW和PSHFRC相对含量最高的菌属分别为马赛菌属、两面神菌属、鞘氨醇单胞菌属和甲基杆菌属,各景点优势菌属及含量差异显著。我国旅游景区空气微生物的研究总体上比较薄弱,因此有必要加强与人类活动密切相关的旅游景区空气微生物群落结构及多样性特征研究。