高压氧和丹参酮ⅡA联合治疗大鼠肾缺血-再灌注损伤的疗效观察*

宋 涛,陈宗平△,田德美,刘 通,梁国标,谢智慧,邹成洪,姚淯洪,黎 旭,许 强

(遵义医学院附属医院:1.泌尿外科;2.高压氧科，贵州遵义 563000)

肾缺血-再灌注损伤(renal ischemia-reperfusion injury，RIRI)是临床常见的病理生理过程，其发生的常见原因有休克后微循环再通、肾移植、肾挤压伤、体外冲击波碎石、阻断肾蒂的肾手术等[1]。RIRI的病理生理学复杂，主要表现为近端肾小管细胞损伤，丢失和炎症，导致组织损伤和功能障碍[2-3]。因此，如何减轻或避免RIRI已成为临床医生必须高度重视的问题。目前RIRI的发病机制尚未彻底阐明，可能是多因素共同作用的结果。其中自由基的生成，细胞内钙超载，中性粒细胞的激活及线粒体损伤、细胞内多种酶的激活、血管内皮细胞损伤等细胞代谢紊乱相互作用，造成损伤的恶性循环是其关键所在[4-5]。RIRI是临床上导致缺血性急性肾衰竭(acute renal failure,ARF)的主要原因之一，病死率很高，即便存活的患者亦会产生不同程度的慢性肾功能损害[6]。缺血再灌注后发生的肾微循环障碍和肾血管活性受损是RIRI发生的关键因素，RIRI可维持肾动脉血流量(RABF)下降并阻碍RIRI的完全恢复[7-8]。通过RIRI病理生理机制的持续进展来识别潜在的治疗干预，目前相关研究证明采取不同治疗措施对RIRI治疗有一定效果[9-13]，但对RIRI的治疗并未得到根本解决。高压氧是一种对多种疾病治疗均有理想效果的方法。对高压氧作用机制的研究发现，高压氧可提高血氧浓度，改善各脏器组织氧的供应，改善组织代谢，促进细胞损伤的修复[14-15]。丹参酮ⅡA是中药丹参的活性成分之一，具有广泛的抗RIRI作用[16]。其作用机制同样表现为：对缺氧缺血所致炎性反应的抑制作用、抗纤维化作用、改善能量代谢、清除自由基、减轻钙超载、抗凋亡作用、影响热休克蛋白表达、改善血液流变学及微循环状况[17-18]。但是二者联合治疗RIRI的疗效少见报道。层连蛋白(laminin，LN)参与构成肾小球及肾小管基底膜，对维持肾脏正常结构有重要作用，当RIRI时，肾小球及肾小管基底膜受损时，其表达亦受损；转化生长因子β(transforming growth factor-beta，TGF-β)是一个多功能细胞因子，哺乳动物TGF-β共有3种，其中TGF-β1在肾脏水平最高，且最具有生物活性，是由两条相同的含112个氨基酸的亚单位通过二硫键连接成的二聚体，是由多种细胞分泌的、具有多重生物学效应的细胞因子，对细胞增殖、分化、凋亡及免疫功能具有重要的调节作用，在损伤后组织的修复与重塑、多种疾病的纤维化中起重要作用。既往研究证明纤维细胞在包括慢性肾脏病(CKD)在内的多种疾病中发挥重要作用，促进组织纤维化[19-21]。本文主要通过对比肾功能的变化、检测LN、TGF-β1的表达及病死率来评价高压氧、丹参酮ⅡA联合治疗大鼠RIRI的治疗效果。

1 材料与方法

1.1实验动物分组与模型建造 SD大鼠120只，体质量200～300 g，清洁级，雌雄不限(购自陆军军医大学动物实验中心)，分为RIRI组(A组)，高压氧治疗组(B组)，丹参酮ⅡA治疗组(C组)，高压氧和丹参酮ⅡA联合治疗组(D组)，正常组(E组)，假手术组(F组)，每组均为20只；各组术前均通过尾静脉采血1～2 mL，检测血尿素和肌酐。称重大鼠后以20%水合氯醛按剂量0.1 mL/100 g采用腹腔内注射麻醉，将大鼠仰卧位固定于手术台上，按无菌操作原则手术。A、B、C、D组均开腹用无损伤血管夹夹闭双肾动静脉1 h后开放血流，E组不做处理;F组仅模拟手术操作过程，但不夹闭肾动脉，各组术后均腹腔内注射长效青霉素12.5万单位/只预防感染，关闭腹腔。

1.2方法

1.2.1治疗方法 D组在开放血流前5 min通过尾静脉注射丹参酮ⅡA磺酸钠注射液(剂量按5 mg/kg，购自上海第一生化制药有限公司)，开放血流后行高压氧治疗(高压氧治疗操作方法：将实验动物置于高压氧舱内，纯氧洗舱5 min，升压5 min至0.2 mPa(2ATA),稳压吸氧40 min，减压10 min。高压氧处理时持续通风，氧流量维持在1 L/min，舱内氧浓度在98%以上)。术后第1、2、3天再行高压氧、丹参酮ⅡA联合治疗共4次。B组单纯用高压氧治疗(方法同上)。C组单纯用丹参酮ⅡA治疗(方法同上)。A、E、F组不用治疗，直接观察。

1.2.2标本采集 术后1、3、5、7、14、30、60、90 d各组分别通过尾静脉采血1～2 mL后离心取上清液检测血尿素和肌酐。其间观察各组的死亡数并记录具体死亡时间，解剖大鼠观察各器官，尤其是肾脏的病理变化情况，分析死亡原因，并在术后90 d将各组存活大鼠处死，取肾脏标本4%多聚甲醛固定，按石蜡切片制作过程(固定、脱水、透明、包埋)制作蜡块以备HE染色及免疫组化用。

1.2.3肾功能检测 血液标本经离心后取上清液于本院检验科进行肾功能检测，采用全自动生化分析仪检测(OLYM-PUS AU5400)测定血液中尿素氮及肌酐水平。

1.2.4苏木素-伊红(HE)染色 将4%多聚甲醛固定的各组肾组织标本石蜡块进行切片(厚度为5 μm)，常规脱蜡至水，行HE染色，中性树胶封片，显微镜下观察。

1.2.5免疫组织化学检测 (1)将肾组织石蜡切片(5 μm)常规脱蜡至水，二甲苯Ⅰ10 min，二甲苯Ⅱ10 min，无水乙醇5 min，95%乙醇5 min，80%乙醇5 min，75%乙醇5 min。(2)磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.2～7.4)冲洗3次，每次5 min。(3)切片至于3%H2O2室温10 min灭活内源性酶，重复步骤(2)。(4)切片置于柠檬酸盐缓冲液中微波炉中火10 min，中高火5 min进行抗原修复后冷却至室温，重复步骤(2)。(5)5%山羊血清封闭10 min，甩去多余液体，滴加兔抗LN多克隆抗体(1∶200，武汉博士德生物有限公司)40 μL，同时用PBS代替一抗作阴性对照，置于4 ℃冰箱过夜(约18 h)。(6)将过夜标本置于37 ℃恒温箱复温40 min，重复步骤(2)。(7)滴加抗兔二抗(武汉博士德生物有限公司)40 μL，再次置于37 ℃恒温箱孵育30 min，重复步骤(2)。(8) DAB显微镜下显色约10 s，自来水终止并冲洗10 min。(9)HE染色5 min，自来水冲洗10 min，置于1%盐酸化乙醇分化3 s，自来水冲洗5 min。(10)按如下顺序进行脱水透明，75%乙醇5 min，80%乙醇5 min，95%乙醇5 min，无水乙醇5 min，二甲苯Ⅱ10 min，二甲苯Ⅰ10 min。(11)干燥后中性树胶封片固定；用Leica图像分析系统进行分析，每张切片随机采取4个视野，用IPP图像分析软件测量每一视野阳性染色区域的平均吸光度(A)作半定量分析。TGF-β1检测方法同上。

2 结 果

2.1不同时间点各组大鼠血肌酐水平比较 各组大鼠肌酐值基线为(36.23±4.74)mmol/L；E、F组肌酐比较差异无统计学意义(P>0.05)。在RIRI术后1 d肌酐迅速升高，其中A组最高[(274.00±126.60)mmol/L]，与B、C、D组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。在术后3 d时B、C、D组肌酐迅速下降接近正常基线，术后5～7 d恢复正常，A组肌酐在术后3 d后缓慢下降，术后5 d后迅速下降,至术后14 d之后缓慢升高，E、F组保持不变，D组术后90 d升高最明显，与各组比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.2不同时间点各组大鼠尿素氮水平比较 各组大鼠血尿素氮基线为(6.51±0.68)μmol/L，在RIRI术后1 d A、B、C、D组大鼠血尿素氮较E组均明显升高，其中A组最高[(31.21±12.80)μmol/L]，其他依次为C、B、D组，与E、F组比较差异有统计学意义(P<0.05)。E、F组大鼠血尿素氮水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。在RIRI术后3 d时B、C、D组大鼠血尿素氮均明显下降，而A组大鼠血尿素氮继续升高，在术后3 d达到高峰[(35.60±23.25)μmol/L]，与B、C、D组比较差异有统计学意义(P<0.05)。各组血尿素氮均在术后14 d基本恢复正常；除E、F组外，其余各组大鼠血尿素氮在术后14 d再次缓慢升高或降低，在术后90 d时D组升高明显[(10.55±0.24)μmol/L]，与其余各组比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表1 各组大鼠不同时间点血肌酐水平比较

续表1 各组大鼠不同时间点血肌酐水平比较

a：P<0.05，与同时间点A组比较；b：P<0.05，与同时间点D组比较；c：P<0.05，与同组术前1 h比较；d：P<0.05，与同组术后1 d比较

A：A组与D组比较；B:B组与D组比较；C：C组与D组比较；D：D组与E组比较；E：D组与F组比较；F：A组与E组比较

图1 D组大鼠与其余各组大鼠的生存曲线比较

图2 各组大鼠病理改变(HE，×400)

组别术前1 hn尿素氮术后1 dn尿素氮术后3 dn尿素氮术后5 dn尿素氮术后7 dn尿素氮A组206.68±1.442031.21±12.80c1935.60±23.25c1719.38±9.74cd177.36±1.18dB组206.39±0.272023.24±12.64c2010.60±7.56acd209.91±12.13ad206.45±0.98adC组206.63±0.261924.52±11.42c1811.52±5.62acd177.87±2.31acd176.93±1.61dD组206.68±0.591820.15±12.18ac189.01±1.31acd178.02±1.33acde146.25±1.24adE组206.36±0.16206.47±0.21ab206.47±0.37ab206.35±0.68ab206.65±0.61aF组206.42±0.37196.38±0.15ab196.44±0.39ab186.44±0.60ab176.58±0.63a

续表2 各组不同时间点尿素氮的变化

a:P<0.05，与同时间点A组比较;b:P<0.05，与同时间点D组比较；c:P<0.05，与同组术前1 h比较；d:P<0.05，与同组术后1 d比较

2.3各组大鼠死亡情况 本研究中大鼠共死亡37只，其中A组11只，分别死于RIRI术后2、4、4、12、26、45、45、64、68、72、78 d；B组3只(15.00%)，分别死于RIRI术后10、25、38 d；C组5只(25.00%)，分别死于RIRI术后1、3、4、58、75 d；D组12只(60.00%)，分别死于RIRI术后1、1、4、6、6、6、35、37、45、63、68、75 d；E组2只(10.00%)，分别死于术后63、74 d；F组4只(20.00%)，分别死于术后1、4、6、58 d。A组大鼠病死率为55.00%，D组大鼠病死率为60.00%，与E组病死率10.00%比较，差异有统计学意义(P<0.05)。将不同处理策略对大鼠生存率的影响进行Cox回归模型分析，提示RIRI(RR=7.170,P=0.010,95%CI：1.587～32.389)、高压氧和丹参酮ⅡA联合治疗(RR=8.735,P=0.005,95%CI：1.951～39.114)均是大鼠死亡的危险因素，即：发生RIRI导致大鼠死亡风险是未发生RIRI的7.170倍，高压氧和丹参酮ⅡA联合治疗导致大鼠死亡风险是E组的8.735倍。

2.4D组大鼠与其余各组大鼠的生存曲线比较 采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，并用Log-rank检验比较D组与其余各组大鼠生存曲线。D组与A组的中位生存时间分别是63、72 d，两组比较差异无统计学意义(χ2=0.259，P=0.611)，见图3A；B、C、E、F组中位生存时间均大于90 d，与D组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1B～F。

2.5各组大鼠HE染色切片 与E组比较，A组可见肾小管上皮细胞空泡改变，肾小管可见细胞脱落，管腔内可见蛋白管型；而B、C组仅少见肾小管细胞脱落，未见蛋白管型；D组可见肾小管细胞脱落，肾脏组织纤维化，见图2。

2.6各组大鼠LN、TGF-β1表达水平比较 LN的表达在各组中依次升高，E、F组表达最强，两组比较差异无统计学意义(P>0.05)，E、F组与其余各组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；在A组表达最低，其与B、C组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；D组与B、C、E、F组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。TGF-β1在E、F组中表达最低，两组比较差异无统计学意义(P>0.05)；在D组中表达最强，其与其余各组比较差异均有统计学意义(P<0.05)，C组与其余各组比较差异均有统计学意义(P<0.05)，见表3。在不同治疗组中，可看到LN在各组中随着各组肾脏损伤的程度不同，LN的表达也各不相同，LN主要表达与肾小管基底膜，E组可见肾脏LN表达连续，表达较强，而在A组，其表达不连续且表达较弱，甚至不表达，见图3。TGF-β1主要表达与肾小球及肾小管，E组表达较少，A组表达较强，D组表达最强，且组织纤维化严重，失去正常肾脏形态，见图4。

图4各组大鼠TGF-β1蛋白表达(图中黄色区域为表达部分，×400)

表3 LN、TGF-β1在各组的表达OD值

a:P<0.05，与E组比较；b:P<0.05，与B、C组比较；c:P<0.05，与C组比较；d:P<0.05，与A组比较

3 讨 论

RIRI是临床常见的病理生理过程，是引起急性肾损伤的重要原因之一，主要表现为肾功能下降，肾小球滤过功能受损，血尿素氮和肌酐迅速升高，水、电解质和酸碱平衡紊乱[22]；其病理表现主要为肾小管细胞水肿，上皮细胞脱落及空泡形成[23]。通过实验建立RIRI模型，发现血肌酐及血尿素氮在损伤后急剧升高，病理检查可见肾小管上皮细胞脱落，肾小管空泡形成，这与既往研究实验结果相符。RIRI已越来越受到临床的关注，大量实验已证实多种药物对RIRI治疗有效，但既往实验多主要研究短期药物疗效，对远期肾脏功能恢复情况及存活情况研究甚少。高压氧及丹参酮ⅡA是已被证实治疗RIRI有效的药物，二者联合治疗对RIRI是否有效，长期治疗对RIRI后大鼠存活的影响鲜见报道。

本实验主要通过检测肾脏滤过功能(血肌酐、尿素氮的变化)，对各组大鼠病死率、生存分析、病理图片检查及免疫组织化学测定LN、TGF-β1的表达评估治疗效果。高压氧的主要生理作用是将溶解在血浆中的氧气量增加到足以支持组织的水平，而减少需要提取由血红蛋白携带的氧气。 其具有许多有益的生化效应[24]。高压氧治疗可以减轻RIRI后血浆肌酐的增加、肾小球滤过率(GFR)的恶化和组织病理损伤，抑制细胞凋亡促进肾小管再生从而改善肾脏功能[14-15]，通过实验本研究发现高压氧治疗后肾脏滤过功能短期内得到明显改善，继续观察至损伤后90 d，发现血肌酐及血尿素氮均有较小幅度的缓慢升高，但对大鼠生存率无明显改变，其病死率较小；病理检查发现肾小管上皮细胞脱落、空泡较A组少，这与既往研究结果相符。丹参酮ⅡA具有对缺氧缺血所致炎性反应的抑制作用，改善能量代谢、清除自由基、减轻钙超载、抗凋亡作用、影响热休克蛋白表达、改善血液流变学及微循环状况[21-24]，实验可以证明在RIRI后丹参酮ⅡA可以抑制血肌酐、尿素氮的升高，改善肾功能及维持肾脏正常结构；远期仍有小幅度的血肌酐尿素氮升高，但大鼠存活率仍高于A组，丹参酮ⅡA治疗有效。高压氧和丹参酮ⅡA联合治疗后肾脏滤过功能在短期内明显改善，但与单纯高压氧及丹参酮ⅡA治疗无明显优势；在损伤后90 d组大鼠血肌酐、尿素氮缓慢上升，与B、C组有明显差异；通过比较大鼠生存曲线发现D组大鼠生存率低于B、C组，观察病理图片见肾脏组织破坏过重，肾小管萎缩，肾脏纤维化，可以证明高压氧和丹参酮ⅡA联合治疗较单纯高压氧及丹参酮ⅡA治疗远期疗效较差，且增加病死率。通过免疫组织化学检测LN、TGF-β1的表达，发现在RIRI后LN表达减少而TGF-β1表达增强，既往实验证实LN主要表达与肾小管及肾小球基底膜，维持肾脏正常结构；TGF-β1可抑制细胞外基质的降解来促进纤维化，最近的研究也证实了TGF-β1能够将纤维细胞导入各种受伤器官中[21-22]，导致器官纤维化。本实验与上述研究相符，观察各组LN的表达，发现在B、C组LN表达较A组表达增强，而D组表达较少，与A组无明显差异，可以证明联合治疗后肾脏组织的损伤未得到纠正与保护。观察TGF-β1的表达可见D组表达明显增强，其病理图片纤维化严重，与既往实验结果相符，可以证明联合治疗后TGF-β1的表达增强促进纤维化形成。通过比较不同治疗方法与大鼠生存状态的关系可以发现RIRI未治疗及高压氧和丹参酮ⅡA联合治疗是大鼠死亡的危险因素，且高压氧和丹参酮ⅡA联合治疗的危险度强于RIRI未治疗。

高压氧、丹参酮均对RIRI治疗有效，二者联合治疗早期效果较好，但预后较差。本次实验均在早期予以治疗，后期观察其疗效，各组在肾功能恢复正常后再次出现缓慢升高，其中D组升高较为明显，对于D组肾脏滤过功能恢复正常后出现缓慢升高的趋势，本研究考虑可能是肾脏健存肾单位负荷过重，晚期功能受损引起。BRICKER等[25]提出的矫枉失衡学说(Trade-off Hypothesis)是指机体产生的某种代偿机制在发挥维持某种溶质平衡的适应性反应的同时，对其他系统产生有害作用，导致机体内环境紊乱；在肾脏发生损伤时肾脏通过加强健存肾单位的功能维持机体的平衡，从而加重肾单位的负荷，导致晚期肾单位因过度滤过，硬化而丧失功能[26]。推测在损伤发生后，高压氧和丹参酮ⅡA联合治疗早期促进健存肾单位的滤过，肾功能改善较为明显，二者联合治疗使健存肾单位负荷过重，在远期健存肾单位受到损害，从而导致肌酐、尿素氮的逐渐升高，远期病死率增加。在健存肾单位受损的过程中通过促进TGF-β1表达增强，抑制小管细胞的增殖并诱导其凋亡及细胞外基质的降解，促进纤维化，从而导致远期肾脏滤过功能受损并加重其病死率，但相关机制尚需进一步实验证明。

本次试验主要存在的局限性：(1)试验过程中，仅在大鼠出现伤亡时取肾标本及在观察结束时即术后90 d处死存活大鼠取肾标本了解肾脏的病理改变，存在一定的局限性，如能在术后14、30、60 d分别行存活大鼠肾穿刺活检，了解肾脏的病理改变，也许更加合理；(2)试验主要采用血肌酐及血尿素氮评估RIRI的指标，对于RIRI是否导致其他病变尚不明确，对病死率的分析也存在一定限制。

综上所述，在RIRI后肾脏滤过功能及形态结构发生改变，肾功能严重受损。单纯高压氧治疗能够增加大鼠RIRI后存活率，高压氧和丹参酮ⅡA联合治疗大鼠RIRI与单纯高压氧、单纯丹参酮ⅡA治疗比较，并无明显优势，且联合治疗增加了大鼠的病死率。