一株铁皮石斛内生真菌的色素稳定性研究

雒晓芳，许淑娟，潘和平*

1西北民族大学实验教学部；2西北民族大学生命科学与工程学院，兰州 730030

铁皮石斛是兰科石斛属的多年生草本植物。不仅是传统的珍贵中药材，也是高档的观赏花卉，拥有很高的观赏价值。铁皮石斛含有多种内生真菌，但只有一些内生真菌能有效地促进石斛的生长发育，组织、宿主、环境等因素的影响在组织和宿主中表现出一定的差异[1]。

微生物与植物体相互作用关系由来已久，大多数植物体的根、茎、叶中都分布着数量众多和种类繁多的微生物[2]。内生菌作为植物微生态系统中的天然组成部分，对植物具有多方面的积极作用。在生物防治上，植物内生菌系统地分布于植物体内，有充分的碳源和氮源的供应，比暴露于外界的恶劣环境中更有利于发挥作用[3]。所以具有重要经济价值和药用价值的铁皮石斛内生真菌成为筛选新活性物质的重要资源[4-8]。

随着人们对天然色素的关注度不断提高，现在人们发现某些细菌、真菌等微生物产生的色素也可以作为天然染料用于纺织品的染色中，成为天然染料的新的一大来源[9-11]。天然色素的色泽不稳定，在使用过程中易受多种因素(如光、温度、氧化、pH值、介电极性等)的影响，并影响褪色和变色，影响其着色效果[12-18]。因此研究色素的稳定性具有非常重要的意义。

本实验从铁皮石斛中分离出1株产色素的内生真菌，其色素为水溶性胞外色素。以这株产橙红色色素铁皮石斛内生菌为材料，对产生橙红色色素的稳定性进行初步探究，为该色素进一步开发利用奠定基础。

1 材料

1.1 实验材料

在云南省普洱市宁洱县五里坡选取生长优良，表面无病虫害的仿野生生长三年以上整个植株。观察形态特征，绿杆“硬脚”，植株茎较圆，与节部有黑褐色环状间隙，萼片和花瓣黄绿色，经由西北民族大学生命科学与工程学院郭鹏辉老师和实验教学部微生物学分室的雒晓芳老师鉴定为铁皮石斛(Dendrobiumofficinale)。

1.2 培养基

麦芽汁琼脂培养基：氯霉素0.1 g ，pH为6.0±0.2，麦芽膏粉30 g ，琼脂15 g蒸馏水1 L，121 ℃高压灭菌30 min。

马铃薯琼脂糖培养基(PDA)， pH为6.0：把土豆冲洗干净，去皮。将200 g切成小块，加入纯水1 L，煮沸半小时，补纯水至1 L。在滤液中加入10 g琼脂，煮沸后加入20 g糖，溶解(用糖培养霉菌，用葡萄糖作酵母培养物)补水，121分钟灭菌30 min。

高盐察氏培养基：氯化钾0.5 g，硫酸亚铁0.01 g ，氯化钠60 g ，蔗糖30 g ，琼脂20 g ，蒸馏水1 L， 121 ℃高压灭菌30 min。

营养琼脂培养基：牛肉膏 1 g ，酵母膏 2 g，蛋白胨 5 g ，NaCL 5 g ，琼脂 15 g，加水定容至1 L。调pH为7.4，加热溶解，121 ℃高压灭菌30 min。

LB固体培养基：胰化蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 5 g，琼脂粉15 g，摇动容器直至溶质溶解。用5mol/L NaOH调pH至7.4，去离子水定容至1 L。 加热溶解，121 ℃高压灭菌30 min.。

营养肉汤培养基：牛肉膏1 g ，酵母膏2 g，蛋白胨5 g，NaCl 5 g，琼脂15 g，加水定容至1 L。调PH为7.4，加热溶解，121 ℃高压灭菌30 min。

LB液体培养基：胰化蛋白胨10 g，酵母提取物 5 g，NaCl 5 g，摇动容器直至溶质溶解。用5mol/L NaOH调pH至7.4，去离子水定容至1 L。 加热溶解，121 ℃高压灭菌30 min。

1.3 试剂

盐酸、蔗糖、氢氧化钠、无水乙醇、异丙醇、10%SDS、双氧水、1X TAE(pH 8.0)、1%氯化汞、亚硫酸钠、硫酸双氢链霉素、青霉素G钾 、10 mg/mL Rnase(Sigma)、PCR试剂盒、乳酸石炭酸棉蓝染色液、5%石炭酸水溶液。

2 方法

2.1 菌种筛选

选取新鲜健康的铁皮石斛植株的根段、茎段和叶片用流水冲洗干净，按照插片法将切片等距离均匀分别放置于含链霉素(50～100 mg/L)和青霉素(100～300 mg/L)的5种固体培养基上(3～4片/皿)，分别为麦芽汁琼脂培养基、高盐察氏培养基、营养琼脂培养基、LB固体培养基、PDA培养基。于26 ℃黑暗条件下培养5～10天待切片周围长成肉眼可见的菌落时，以平板划线法分离真菌培养。将初筛后获得的一株优势菌种连续富集培养三次。富集培养均无出现杂菌，继续以平板划线法分离纯化菌株，重复三次。通过肉眼对培养特征的观察选择生长优良的菌株。将所得的单菌株接于斜面上26 ℃培养3～5天后，4 ℃保存备用。

2.2 真菌鉴定

真菌菌体用液氮研磨后提取总DNA，然后用ITS扩增引物ITS1和ITS4进行PCR扩增并测序。将测序结果与NCBI数据库(NR) 进行比对，并将序列进行BLAST比对，构建进化树。

2.3 色素测定

2.3.1 色素的提取

用接种环取活化后的菌丝体于麦芽汁琼脂固体培养基中，在 26 ℃恒温黑暗培养3～5天。至产生的色素达到饱和时除去菌丝体，保留仅存色素的培养基，然后按体积比1∶2(w/v)加入蒸馏水在60 ℃水浴条件下进行浸提1 h，经过8层纱布过滤掉培养基等大块的固体杂质，用滤纸过滤后37 ℃烘箱干燥得到橙红色素粗提物。用蒸馏水配制浓度为 1% 的色素溶液作为母液。

2.3.2 色素吸收光谱曲线的测定

取1%的色素溶液，用G10S UV-VIS双光束紫外可见分光光度计在 300～700 nm 范围内扫描，以 10 nm为扫描间隔，记录数据，利用 Excel软件分析找到最大吸收波长。测出的最强吸收峰波长值将作为后续实验中的参考值。

2.3.3 色素色价测定

色价测定参照GB 1886.34-2015 “食品安全国家标准食品添加剂辣椒红”的方法做了适当调整：准确称取0.25 g 色素粗品，精确至 0.000 2 g，用蒸馏水溶解于 25 mL 的容量瓶中，配制成浓度为 1% 的色素溶液，适当稀释使吸光值控制在 0.3 ～ 0.7 范围内，用蒸馏水为对照，测定其在最大吸收波长处的吸光值。色价 E 和色价保存率计算公式如下：

2.4 色素的稳定性研究

2.4.1 温度对色素稳定性的影响

取适当稀释后的色素溶液，分别置于 4、20、40、60、80、100 ℃ 恒温水浴锅中避光保温 1 h，迅速冷却至常温观察颜色变化，以蒸馏水为对照分别测定其在最大吸收波长处的吸光值，计算色素色价保存率。

2.4.2 pH对色素的影响

取适当稀释后的色素溶液，分别用 1mol/mL NaOH 和 1mol/mL HCl调节 pH 为 2、4、6、8、10、12，室温避光静置 1 h，观察颜色变化，分别测定其在最大吸收波长处的吸光值计，计算色素色价保存率。

2.4.3 光照对色素稳定性的影响

取 5 mL 适当稀释的色素溶液于玻璃皿中，用保鲜膜封口，分别置于自然光照、紫外光照和避光条件下持续处理 24 h，分别测定其在3、6、9、12 h时的最大吸收波长处的吸光值，计算色素色价保存率。

2.4.4 氧化剂与还原剂对色素稳定性的影响

取9 mL 适当稀释的色素溶液，分别加入 1 mL浓度为 0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%的氧化剂 H2O2和浓度为 0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%的还原剂Na2SO3。室温避光静置 1 h，分别测定其在最大吸收波长处的吸光值，计算色素色价保存率。

2.4.5 金属离子对色素稳定性的影响

取9 mL 适当稀释的色素溶液，分别加入 1 mL浓度为1%的5种金属离子溶液FeCl3、ZnSO4、CuSO4、CaCl2和MnCl2，室温避光静置1 h，分别测定其在最大吸收波长处的吸光值，计算色素色价保存率。

2.4.6 常见添加剂对色素稳定性的影响

取9 mL 适当稀释的色素溶液，分别加入 1 mL浓度为5%、10%、15%、20%、25%的NaCl、蔗糖、葡萄糖溶液。室温避光静置 1 h，分别测定其在最大吸收波长处的吸光值，计算色素色价保存率。

3 结果与分析

3.1 菌株的形态特征

用5种不同的固体及对应的液体培养基经过初筛、富集培养以及分离纯化，得到一株铁皮石斛优势内生真菌，将其命名为X1。菌株 X1菌落在麦芽汁琼脂培养基上培养26 ℃培养3天，即形成较典型的菌落，菌落呈白色、蛛网状，无隔。分生孢子梗发生于基质，壁平滑，帚状枝为双轮生或三轮生，梗基每轮2～3个，瓶梗每轮4～8个，分生孢子为椭圆形，壁平滑，分生孢子链圆柱状。

3.2 分子生物学鉴定

3.2.1 16S rDNA扩增

图1 X1的 PCR电泳图Fig.1 Electrophoretic diagram of X1

Marker条带组成：100 bp，250 bp，500 bp，750 bp，1 000 bp，2 000 bp，3 000 bp，5 000 bp。750 bp条带浓度为60 ng/3 μL，显示为加亮带，其余条带浓度均为30 ng/3 μL。电泳方向从下向上。

3.2.2 进化树构建

将X1菌株铁皮石斛内生真菌优势菌的16S rDNA的核酸序列经序列用比对用软件MEGA5.1进行多重比对并绘制了系统进化树。结果如图2所示。结果表明：X1菌株与链孢霉菌属中的Neurosporaafricana的16S rDNA序列有99%的同源性，可见X1与链孢霉菌具有较近的遗传距离。结合形态学及分子生物学染色实验结果综合分析，将X1与链孢霉菌属中的Neurosporaafricana具有较近的遗传距离。

图2 X1系统进化树Fig.2 Ehylogenetic tree of X1

3.3 色素稳定性

3.3.1 不同波长条件下色素紫外吸收光曲线

图3 不同波长下橙红色色素的OD曲线Fig.3 The OD curve of orange red pigment at different wavelengths

由图3可知，300～210 nm范围内为下降趋势，320～400 nm范围内为持续上升，至400～700 nm为缓慢下降的趋势，故可得最大吸收峰为波长λ为400 nm。故本实验选择400 nm 作为最大吸收波长。

3.3.2 不同温度条件对色素色价的影响

图4 不同温度对色素色价的影响Fig.4 The effect of different temperatures on the color color of the pigment

由图4可知，20～60 ℃时色素的保存率处于上升阶段，60～100 ℃是色素的保存率则处于连续下降阶段，温度为60 ℃时其色价保存率最好为82%即对色素的影响较小，对色素有护色反应。所以选择60 ℃作为该色素的提取温度。

3.3.3 不同pH值对色素色价的影响

图5 不同pH值对色素色价的影响Fig.5 The effect of different pH on the color value of pigment

用 1mol/m L Na OH 和 1mol/m L HCl调节经稀释的色素溶液的pH 分别为 2、4、6、8、10、12，室温放置1 h，取不同pH的1 mL色素溶液测定吸光度值。由图5可知，pH为2～8时的色价保存率持续上升，pH在8～12的时候连续下降，所以色价保存率最好为pH=8时，色价保存率为56%。说明pH的变化对色素的色价影响较大。色素宜储存于中性或弱碱性环境，强碱性环境比酸性环境对色素的色价稳定性影响更大。

3.3.4 不同光照条件对色素稳定性的影响

图6 不同光照条件对色素色价的影响Fig.6 The effect of different light on the color price of pigment

将10 mL色素溶液放置于自然光、紫外、避光三个条件下室温持续处理12 h。每3 h取1 mL的色素溶液测定吸光度值。由图6可知，紫外条件下，0～6 h范围内色素溶液的色价持续上升，6～12 h色素溶液色价持续下降。自然光条件下，0～3 h色价先下降，3～6 h色价上升，6 h后色素溶液色价持续下降。避光条件下，对该色素色价的影响可忽略不计。在自然光和紫外条件下， 6 h时均会发生增色反应，间接证明紫外对该色素具有增色反应。避光条件下，对该色素的色价影响可忽略不计，可将色素溶液避光保存。

3.3.5 不同浓度H202和Na2SO3溶液对橙红色素稳定性的影响

图7 H202和Na2SO3对色素色价的影响Fig.7 The effect of H2O2 and Na2SO3 on color value of pigment at different concentrations

由图7可知，经氧化剂H202和还原剂Na2SO3处理后，色素对H202和Na2SO3溶液较敏感。随着浓度的上升，整体呈下降趋势，对色素一直保持减色反应。

3.3.6 不同金属离子对色素稳定性的影响

图8 不同金属离子溶液对色素色价的影响Fig.8 The effect of different metal ion in the solution of the dye color value

由图8可知，浓度为1%的Fe3+、Zn2+、Cu2+、Ca2+和Mn2+5种金属离子溶液对色素溶液均有不同程度影响。其中，Fe3+、Ca2+对色素溶液具增色反应，Zn2+、Cu2+、Mn2+对色素溶液有保色效果。

3.3.7 不同常见添加剂对色素稳定性的影响

由图9可知，经不同浓度NaCl溶液处理后，5%～10%范围内色素色价呈上升趋势，于10%时色素色价达到峰值，10%之后色素溶液色价持续下降。经不同浓度葡萄糖溶液处理后，5%～15%范围内色素色价呈上升趋势，15%时色素色价达到峰值，15%～25%色素溶液色价持续下降。不同浓度的蔗糖对该色素的色价几乎没有影响。

图9 不同常见添加剂对色素色价的影响Fig.9 The effect of different common additives on color Price of pigments

4 讨论

内生真菌(endophytic fungi) 指长期生活在植物的根、茎、叶等器官的组织内部，但一般不引发植物体病害的真菌。链格孢是经济上重要的真菌属之一。大多数种类兼性寄生于植物上， 引起多种经济植物病害，造成田间和产后损失。有几个链格孢小孢子种可侵染人和动物， 引起皮癣、甲癣、颚骨髓炎等疾病。链格孢产生的某些真菌毒素是重要的致癌因素。另一方面， 链格孢也是有应用潜力的生物资源， 如一些链格孢次生代谢物具有杀虫、杀菌和杀原生生物活性。长柄链格孢中某些菌株分生孢子壁中含有激发子组份， 可被用来制成防治烟草赤星病的生防制剂等[19]。X1菌株与脉孢菌中的Neurosporaafricana亲源关系最近，为99%。脉孢菌属在遗传研究及生化途径研究上广泛应用，且其菌体内含丰富蛋白质、维生素B12等，可用于工业发酵和制作饲料。

发现并选择能够大量生产色素的真菌，作为一种新型的天然染料应用与纺织品的染色中，利用真菌培养的优势对于色素进行工业化生产，将有望解决天然植物染料不能满足人们的需求的难题，使得天然染料更好的为人们使用[20]。因此，本实验选择X1内生真菌所产生的橙红色色素对其稳定性进行初期研究。经研究分析，发现该水溶性橙红色色素色价保存率易受到批次影响，不同批次的1%色素溶液色价均有差异。并且也发现该色素溶液不能低温保存，低温保存对其色价有很大影响。每次提取配制的色素溶液，只可以于常温避光放置一周。后续实验将会通过多个单因子实验和正交实验对橙红色色素的提取工艺进行优化，为色素进行工业化生产提供理论依据。