荧光定量 PCR检测原料乳中粘质沙雷氏菌

姜鸿瑞，韩紫音，夏海磊，王梦琦，冀德君，毛永江，杨章平，张慧敏

（扬州大学动物科学技术学院，扬州 225009）

粘质沙雷氏菌（S.marcescens）属于革兰氏阴性菌，亦称灵杆菌[1]，是一类肠道杆菌，普遍存在于水和土壤中，可在低温下生长繁殖，低温食品极易受其污染，如乳制品、水产品、禽类产品等。此外，S. marcescens是一种条件性致病菌，当机体免疫功能低下时就会引起肺炎、败血症、脑膜炎等各种疾病，并且对多种抗生素产生耐药性。近年来，S. marcescens引发感染的事件越来越多，逐渐引起人们的重视。

S. marcescens可分泌多种胞外水解酶，如耐热脂肪酶及蛋白酶，这些酶可水解牛奶中的蛋白质和脂类，进而导致牛奶变质，产生苦味、异味、不洁味等。牛奶的热处理工艺虽然可以杀灭微生物，但对耐热酶没有作用，耐热酶的活性基本不受影响，给乳制品安全带来巨大的隐患[2,3]。研究发现，S. marcescens是原料乳低温贮藏期间的主要嗜冷菌之一，由此可见，快速、准确地检测原料乳中S. marcescens对保障原料乳质量安全有重要意义。

近年来，随着分子生物学技术的发展，荧光定量PCR技术被广泛地应用于原料乳中致病菌的检测，如金黄色葡萄球菌、沙门菌属等[4]。为了准确、高效地检测原料乳中的S. marcescens，本研究选取对S. marcescens有特异性的S-核糖基高半胱氨酸酶（luxS）基因作为检测的靶基因[5]，建立原料乳中S.marcescens的高灵敏、高特异的实时荧光定量PCR快速检测体系，为原料乳的质量安全提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

粘质沙雷氏菌ATCC14756、荧光假单胞菌ATCC13525、鲁氏不动杆菌ATCC15309、阪崎肠杆菌ATCC29544购自美国模式培养物集存库；金黄色葡萄球菌ATCC29213、大肠杆菌JM109由本实验室提供；沙门氏菌ATCC13076、李斯特菌ATCC15313由扬州大学兽医学院药理与毒理实验室提供；pUCm-T和大肠杆菌感受态细胞购自上海Sangon公司；Taq酶、DNA纯化试剂盒、SYBR® Premix Ex Taq™ II (TliRNaseH Plus)和DNA Marker均购自大连TaKaRa公司；细菌基因组DNA提取试剂盒DP302购于天根生化科技有限公司；其他试剂均为国产或进口分析纯。梯度PCR仪及ND-1000微量紫外可见光度计为美国赛默飞世尔科技公司产品；荧光定量PCR扩增仪7500为美国ABI公司产品；凝胶成像分体系统为SYNGENE公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 引物设计及合成

根据文献中报道的对S. marcescens有特异性的luxS基因（GenBank登录号：EF164926.1，AJ628150.1）设计特异性引物[5]。引物由上海生物工程公司合成，引物序列见表1。

表1 引物序列

1.2.2 luxS基因克隆

S. marcescens在LB培养基中培养12h，取1mL离心收集菌体，参照细菌DNA提取试剂盒说明书提取DNA。以S. marcescens的DNA为模板，SM-F、SM-R为引物进行PCR，然后将PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收后连入pUCm-T质粒，转化大肠杆菌感受态细胞，经平板筛选和酶切鉴定正确后，送上海生物工程公司测序。

1.2.3 荧光定量PCR标准曲线的建立

将S. marcescens在LB培养基中培养过夜，用平板菌落记数法定量，采用LB培养基进行10倍梯度稀释，得到不同浓度菌液。提取梯度浓度菌液的基因组DNA，然后采用实时定量PCR试剂盒进行扩增。PCR扩增反应体系为20μL：SYBR Premix Ex TaqⅡ 10μL；SM-F 0.8μL，SM-R 0.8μL；DNA模板 2.0μL；ddH2O 6.0μL；Rox Reference Dye Ⅱ 50×0.4μL。PCR反应条件为：95℃ 30s；95℃ 5s，61℃ 34s，40个循环；在61℃退火阶段收集荧光值，并在上述扩增条件后增加60～95℃的融解曲线分析。每个样本3个平行，进行荧光定量PCR后得到相应的Ct值，以菌落数的lg值和Ct值制作标准曲线。

1.2.4 特异性试验

提取6种乳中常见微生物（金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、李斯特菌、阪崎肠杆菌、荧光假单胞菌）的基因组DNA，并分别以其为模板，采用1.2.3中的荧光定量PCR方法进行扩增，以S. marcescens作为阳性对照，检测该方法的特异性。

1.2.5 灵敏度评价

以1.2.3中获得的梯度浓度S. marcescens基因组DNA为模板，SM-F和SM-R为引物进行常规PCR，其反应条件为：95℃ 3min，30个循环（95℃ 30s，61℃30s，72℃ 30s），72℃ 10min。评价荧光定量PCR与普通PCR检测方法的灵敏度。

1.2.6 人工阳性样品乳检测

将1.2.3中已经定量的菌液，采用灭菌全脂乳进行10倍梯度稀释，得到不同浓度菌液。离心去脂肪，沉淀用无菌生理盐水洗涤两次，然后采用文献中报道的方法提取人工阳性样品乳中的DNA[6]，并按照1.2.3中的方法进行荧光定量PCR扩增。

1.2.7 荧光定量PCR检测原料乳中的S. marcescens

在不同的月份(2015年的11月、12月份及2016年的1月份)，从江苏省扬州市周边8个奶牛场中采集原料乳样品，提取奶样DNA，进行荧光定量PCR及常规PCR检测，确定每个牧场的原料乳是否污染了S.marcescens，以此监控每个牧场的奶源质量。

2 结果与分析

2.1 PCR产物的凝胶电泳

首先以S. marcescens的DNA为模板，利用引物SM-F和SM-R进行PCR，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图1(泳道1)所示。图1显示，在180bp处有一特异性条带。将目标条带进行割胶回收后连入质粒pUCm-T进行测试，测序结果显示luxS部分基因片段长度为175bp，与拟克隆的基因序列只有1个碱基不同，与理论片段同源率为99.43%。

图1 luxS基因 PCR产物琼脂糖凝胶电泳

2.2 荧光定量PCR标准曲线

将S. marcescens过夜培养，采用菌落平板记数法定量菌液浓度为6.9×109cfu/mL，经稀释后，得到不同浓度菌液（6.9×101、6.9×102、6.9×103、6.9×104、6.9×105、6.9×106、6.9×107cfu/mL）。以细菌数的lg值和Ct值制作荧光定量PCR的标准曲线（y=-1.864x+31.32，相关系数为0.999），结果表明不同梯度浓度细菌数的lg值与Ct值之间具有良好的线性关系[7～9]，荧光定量PCR的Ct值与初始模板在6个lg浓度范围内（菌落数为6.9×107～6.9×102cfu/mL）呈现良好的线性关系。当菌落数达到6.9×101cfu/mL进行扩增后，其Ct值大于水的Ct值（图2），故该浓度下不能对luxS基因进行有效的检测。由此可知，该检测方法的最低检测限可达到6.9×102cfu/mL。

图2 荧光定量PCR扩增

2.3 荧光定量PCR试验的敏感性

通过试验可以确定荧光定量PCR检测的最低菌落数（6.9×102cfu/mL），然后以试验中获得的不同浓度菌液的基因组DNA为模板，SM-F和SM-R为引物进行常规PCR，比较荧光定量PCR与常规PCR的敏感性[10]，如图3所示，常规PCR检测S. marcescens的灵敏度是6.9×103cfu/mL，由此可见荧光定量PCR的灵敏度较高。

图3 常规PCR检测luxS的灵敏度

2.4 荧光定量PCR试验的特异性

如图4所示，荧光定量P C R结果显示只有S.marcescens样品出现了较强的荧光信号，而其余6种乳中常见微生物均未出现相应的荧光扩增曲线。经过溶解曲线分析，特异性溶解曲线呈现单一峰形。说明该方法检测S. marcescens具有良好的特异性。

图4 荧光定量PCR方法特异性验证

2.5 荧光定量PCR方法的应用

在不同的月份，从江苏省扬州市8个奶牛场中取样原料乳，提取奶样DNA，进行荧光定量PCR及常规PCR检测，结果如表2所示，所有样品的Ct值均不在检测范围中，说明这8个牧场这三个月里都没有感染S.marcescens。同时，常规PCR检测结果也未检出阳性样品。

表2 不同牧场不同月份原料乳中S. marcescens荧光定量PCR检测结果

3 讨论与结论

本研究建立了S. marcescensluxS基因的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法，通过此方法，得出了人工污染奶样的标准曲线y=-1.864x+31.32，相关系数为0.999，菌液浓度为6.9×107～6.9×102cfu/mL，对应的Ct值范围是16.70～26.02[11]。本研究中荧光定量PCR对S. marcescens的最低检测限是6.9×102cfu/mL，而常规PCR的检测限是6.9×103cfu/mL。李一松等[12]用荧光定量PCR检测乳中携带sea基因金黄色葡萄球菌，结果表明，该方法可以快速稳定地检测出乳中的金黄色葡萄球菌，并确定了有效检测限是8.3×102cfu/mL。由此可见，荧光定量PCR方法的检测限范围比常规PCR要广。

在采样的8个牧场的原料乳中，所有样品的Ct值均不在检测范围内，说明这8个牧场这三个月的原料乳均未感染S. marcescens。可能是因为这三个采样月正值冬季气温较低，不利于微生物的生长。

本试验建立了荧光定量PCR检测原料乳中粘质沙雷氏菌的方法，方法灵敏度为6.9×102cfu/mL，比常规PCR方法的灵敏度高，且特异性强。与常规PCR相比，荧光定量PCR不仅完成了PCR从定性到定量的提升，更由于灵敏度高、特异性强而降低了相互污染的风险。本试验可以快速检测原料乳中的S. marcescens，可有效提升原料乳的质量安全检测水平，促进乳制品行业的健康可持续发展。