培养温度对嗜热链球菌抑制法检测结果的影响

张小千，李劼

（石河子大学动物科技学院，石河子 832003）

牛乳中的抗生素残留会严重威胁人体的健康，有关牛乳中抗生素含量的检测已成为食品安全的研究热点之一[1]。因此，开展牛乳中抗生素残留快速检测方法的研究显得尤为重要[2]，目前，国外常用的检测方法有生物法、色谱法、免疫分析法、分子印迹技术[3]等，按照GBT4789.27-2008规定[4]，嗜热链球菌抑制法（简称TTC法）是我国鲜牛乳中抗生素残留检测的标准推荐方法[5]，其原理是嗜热链球菌在牛奶中生长会使无色透明的2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）还原为红色的三苯甲臜[6]，当牛奶中抗生素含量超过一定限度时，会抑制嗜热链球菌的生长，使得牛奶中加入的TTC无法被还原，继而达到检测效果。嗜热链球菌抑制法具有简便、灵敏、价廉等优点，并可以检测多种抗生素，目前应用广泛[7]。

嗜热链球菌抑制法中使用的指示菌为嗜热链球菌[8]，根据GBT4789.27-2008，该方法中菌液在牛奶中的培养温度为36±1℃[9]。但是在实际操作中在该温度下加入指示剂后并不能很好地观察到检测结果，易出现假阴性现象。本试验将实验牛奶在六种不同的温度下培养，以确定嗜热链球菌抑制法的最适检测温度，为进一步完善国标的检测方法、增加嗜热链球菌抑制法的可操作性提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源

试验所用嗜热链球菌提取自中国食品发酵工业研究院有限公司，由本实验室保存。

1.1.2 仪器

隔水式恒温培养箱，北京市永光明医疗仪器厂；高速离心机，德国Hettich公司；电热恒温水浴锅，海申生科技有限公司；LX220A电子天平，瑞士普利赛斯公司；HVE-50高压灭菌器，HIRAYAMA公司；洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司。

1.1.3 样品与试剂

生鲜乳，购自石河子大学某小区；卡那霉素，成都乾坤动物药业有限公司生产；2,3,5-三苯基氯化四氮唑，华东师范大学化工厂产品；蛋白胨，北京奥博星生物技术有限责任公司产品；酵母浸粉，北京奥博星生物技术有限责任公司产品；葡萄糖，西安化学试剂厂产品；磷酸氢二钾，上海化学试剂分装厂产品；吐温-80，上海化学试剂厂产品；西红柿汁为自制。

1.1.4 培养基

乳酸液体培养基：酵母浸粉7g，蛋白胨7.5g，葡萄糖10g，磷酸氢二钾2g，10%吐温-80 0.5mL，西红柿汁50mL，蒸馏水950mL。

1.2 方法

1.2.1 嗜热链球菌的活化

将在安瓿管中保存的冻干嗜热链球菌用乳酸菌液体培养基洗入试管中，在恒温箱内49±1℃培养24～36h。

1.2.2 嗜热链球菌的增殖

将活化后的嗜热链球菌接种于乳酸固体培养基，放入温箱，49±1℃培养12～24h。

1.2.3 嗜热链球菌使用液的制备

将乳酸菌固体培养基上的菌落，用无菌水洗入1.5mL EP管中，以5 000r/min离心10min，然后倾掉上清液，称取重量，EP管中沉淀菌用无菌水洗入试管，再对EP管称量，计算菌重，试管中菌量稀释为1mg/mL，待用。

1.2.4 温度对嗜热链球菌生长影响试验

1.2.4.1 平板划线

将上述稀释好的菌液振荡摇匀，用无菌接种环取一环划线培养，在37±1℃、40±1℃、43±1℃、46±1℃、49±1℃、52±1℃下接种两块平板，分别于12h、24h后观察菌落生长情况。

1.2.4.2 菌落计数

将使用液进行10倍梯度稀释，作5个稀释度，即1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍的稀释，然后吸取10-3、10-4、10-5稀释度的菌液1mL加入平皿中，每个稀释度做4个平皿，2个1组，共2组，分别于不同的温度中培养12h和24h，观察记录。

1.2.5 温度对TTC法检测结果影响试验

1.2.5.1 生鲜乳的处理

将购买的新鲜牛奶分为两份，一份加入卡那霉素（在样品中含量为5IU/mL）做阳性对照。将两份牛奶分别加入试管，每管加入4.5mL，做好标记，然后放入恒温水浴锅中80℃灭菌20min后从锅内取出，冷却到37℃以下备用。

1.2.5.2 培养温度设置与观察

取加样试管，在每管中加入0.5mL使用菌液，置于温箱，分别在37±1℃、40±1℃、43±1℃、46±1℃、49±1℃、52±1℃下培养，每个温度分别培养1h、1.5h、2h后，加入TTC指示剂，每30min观察一次结果，共观察记录两次。

2 结果

2.1 嗜热链球菌划线平板的生长情况

嗜热链球菌划线平板生长情况见图1。

图1 不同培养温度、时间嗜热链球菌划线平板生长情况

由图1可以看出，当嗜热链球菌培养温度为37±1℃、40±1℃时，培养基上菌落生长数量略低；培养温度为43±1℃、46±1℃、49±1℃、52±1℃时，菌落生长情况较好；培养温度在49±1℃时，菌落生长情况优于其他温度。

2.2 嗜热链球菌菌落计数结果

表1 不同温度下菌落生长结果 单位：cfu

从表1可知，当培养温度在37℃时，菌落总数平均为1.6×102；培养温度在40℃时，菌落总数平均为8.1×102；培养温度在43℃时，菌落总数约为1.7×103；培养温度在46℃时，菌落总数约为2.3×103；培养温度在49℃，菌落总数约为3×103；培养温度在52°C时，菌落总数约为2.5×103；可见温度在49°C时菌落生长情况最好，菌落总数最多。

2.3 不同温度下TTC法检测结果

表2可以看出，6个实验温度组中加抗牛奶在各温度下加入指示剂均未变色；当嗜热链球菌培养温度在37±1℃时，加入指示剂后都没有颜色变化，可见在该温度时TTC法无法进行检测；当嗜热链球菌培养温度在40±1℃的时候，加入指示剂1h后出现颜色变色，但在相同时间变色程度不佳，TTC法检测观察不明显；当嗜热链球菌培养温度在43±1℃、46±1℃、52±1℃时在相同时间中变色效果较好，且46±1℃＞52±1℃＞43±1℃，但观察结果没有达到预期要求；当嗜热链球菌培养温度在49±1℃时在相同时间内变色效果最好，在培养1.5h后加入指示剂反应30min已经变为红色，其变色效果达到预期要求。

3 讨论

TTC法具有操作简便、价格低廉、易于开展应用等特点，在我国已广泛使用。本试验通过在不同温度下的嗜热链球菌抑制试验，对嗜热链球菌抑制法做了进一步改进。TTC法常用于检测的抗生素为卡那霉素（最低检出限为5IU）、青霉素（0.04IU）、链霉素（0.5IU）、庆大霉素（0.4IU），由于检测卡那霉素的最低检出限为5IU，在加入牛奶中更有利于搅拌均匀，提高实验准确性，所以本试验选择卡那霉素作为加抗对照；同时，本试验采用称重法制备嗜热链球菌使用液，与普通稀释法相比，称重法操作简便，快速，易保持细菌活性，适于TTC法操作过程中对指示菌进行定量。

表2 TTC法检测结果

本试验确定在49±1℃时菌落生长情况最好，变色效果最佳，有利于观察检测结果，符合国家标准要求，提高了该方法检测的准确性。本试验结果完善了乳品安全国家标准，对促进我国乳品行业健康发展起到有益作用。