不同油菜品种对盐碱土壤理化性质与微生物多样性的影响

刘东洋，徐接亮，张凤华

(1.石河子大学农学院， 新疆石河子 832003； 2.石河子大学绿洲生态农业重点实验室， 新疆石河子 832003)

0 引 言

【研究意义】中国盐碱地面积较大，目前盐碱地总面积约达3 600×104hm2，占全国可利用土地面积的4.88%[1]，新疆是中国最大的盐碱地地区。相关研究显示,新疆盐碱土面积占耕地面积30.12%[2]，并且受地理环境、人为因素的限制，例如气候、化肥不合理的施用等多方面的影响，新疆土壤次生盐渍化程度仍在持续加重，盐碱地面积不断扩增，如何有效开发利用盐碱地已经成为迫切要需要解决的问题。传统的盐碱地改良方法有物理改良措施、化学改良措施、生物改良措施等方法，其中生物改良措施具有成本低、经济效益高等诸多优点。盐碱地种植油菜属于生物改良措施，油菜有一定的耐盐能力，其在盐碱地上有着良好的生长表现[3-4]，而在新疆盐碱地地区还尚未有盐碱地种植油菜的报道。通过16S-rRNA高通量测序技术,对于新疆盐碱地区种植油菜具有一定指导意义。【前人研究进展】盐碱土会致使土壤肥力下降，植株根系吸水困难，进而影响作物生长，是限制农业发展的关键性因素之一，研究表明,盐碱地种植作物进行生物改良[5-6]，不仅能够降低土壤盐分、提高土地生产力，而且能有效改善土壤生态环境[7-8]。油菜作为世界主要油料作物[9]，不仅在食用、工业能源等领域备受瞩目，其也是少数用于开发利用盐碱地的作物之一，李国林等[10]研究表明种植油菜可以利用其茎叶覆盖地面，延长了土地绿色覆盖时间，有效抑制了盐碱土壤返盐特点；梅勇[11]研究表明,种植耐盐油菜对于中度重度盐碱地土壤理化性质有一定的改善作用；张培通等[12]研究表明在含盐量0.2%～0.4%的盐碱地上油菜能够良好的生长。【本研究切入点】新疆盐碱化严重，目前有关新疆盐碱地种植油菜鲜有报道。选取不同油菜品种，研究不同油菜品种间土壤理化性质及微生物多样性的变化。【拟解决的关键问题】筛选出更适宜盐碱地生长的油菜品种，为新疆盐碱地开发利用提供理论基础，为盐碱地大面积种植油菜提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

试验地设在新疆石河子垦区石总场四分场，属于高纬度的典型温带大陆性气候，冬季长而严寒，夏季短而酷热，光照充足，雨量稀少，气候干燥，年平均气温6.6℃，年降水量平均180 mm，蒸发量1 600 mm，年平均日照时数2 784 h，无霜期年平均166 d，≥0℃积温3 918℃。

油菜品种为 1、16-22外、华5号、金油158均为甘蓝型油菜，由华中农业大学提供。土壤样品于油菜收获期进行采集。采取五点取样法，取油菜0～20 cm的耕层土壤，剔除土壤表面杂质将土壤样品保存封口塑料袋中，置于冰袋中冷藏迅速带回实验室，然后将土壤样品分为两份，一份土壤样品在-80℃在保存，各品种油菜土壤编号分别为1、16-P22外、华5号、金油158，供土壤微生物多样性分析。另一份土壤样品风干后通过2 mm筛用于土壤理化性质的分析。

1.2 方 法

1.2.1 试验设计

试验于2017年7月16日进行，采取单因素随机区组设计，试验设计4个处理：1、16-P22外、华5号、金油158，三次重复。小区长5.2 m，宽2.1 m，每个小区播7行，行距30 cm，小区播量15 g左右，播种方式为人工撒播。

1.2.2 土壤理化性质

土壤pH测定采用酸度计法(水土比为5∶1)；土壤电导率利用电导仪测定(水土比为2.51)；土壤碱解氮采用碱解扩散法；土壤速效磷采用NaHCO3浸提-钼锑抗比色法测定；土壤速效钾采用NH4Ac浸提-火焰光度法测定，土壤有机质测定采用重铬酸钾容量法-外加热法进行测定[13]。

1.2.3 土壤DNA的提取、PCR扩增

土壤总DNA使用美国MP Biomedicals公司的FastDNATMSpin试剂盒，每个样品称重0.5 g土壤，按照试剂盒说明和参考文献方法进行DNA的提取[14]。提取的土壤总DNA浓度和纯度用分光光度计(NanoDrop 2000)检测。采用文献的方法利用细菌16S rRNA通用引物对测序区域515F-907R(V4-V5区)进行PCR扩增，引物序列为F：515F：(5＇-GTGCCAGGMGCCGCCG-3＇)和R：907R：(5＇-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3＇)[15]。PCR正式试验采用TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase，20 μL反应体系。PCR反应条件：95℃预变性3 min，95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，循环数为27个；72℃ 10 min(GeneAmpR9700, ABI,USA)。

1.2.4 测序

样品经纯化检测后送往中国上海美吉生物医药科技有限公司利用Illumina MiSeq PE300测序平台进行测序。

原始QASQ文件运用QIIME(Quantitative Insights into Microbial Ecology,version 1.9.1)进行序列过滤。序列过滤的标准：(1)过滤Q<20的碱基，过滤50 bp以下的reads ；(2)将成对reads拼接成一条序列，最小overlap 长度为10 bp ，且overlap 区允许的最大错配比率为0.2；(3)检测序列末端barcode 2序列，最小错配数为0，将起始段包含barcode 2的序列进行反向互补并去除barcode 2；(4) 检测序列上barcode 1并区分样品，barcode 1错配数为0，最大引物错配数为2。

1.3 数据处理

通过使用Userch(version 7.1)软件平台对优质序列按相似水平0.97进行OTU聚类，使用UCHIME识别和去除嵌合序列[16]。在QIIME中使用RDP Classifier(version 2.2)对比16S rRNA数据库Silva(Release123)进行分析，置信度阈值为0.7。

根据OTU列表中各个土壤样品物种丰富度情况，应用Mothur软件[17](version v.1.30.1)计算菌群丰富度指数Chao1指数、ACE指数和菌群多样性指数Shannon指数、Simpson指数、Coverage指数。 Venn图可用于统计多个样本中共有和独有的OTU数，使用R语言工具统计，分析时选用相似水平为97%的OTU[18]。稀释曲线利用mothur做rarefaction分析，利用R软件制作稀释性曲线图。主成分分析PCA和相关性Heatmap图由R语言(version 3.42)软件生成。

基于97%相似度的OTU分类学水平，采用对序列进行随机抽样的方法，以抽到的序列数与所能代表的OTU数目构建稀释性曲线。使用97%相似度的OTU，利用mothur计算不同随机抽样下各个样品的丰富度和多样性指数。以OTU的物种分类结果为依据，利用QIME软件对4组油菜土壤样品在门和属的分类级别上对细菌的组成和结构以及相对丰度进行分析。

2 结果与分析

2.1 土壤化学性质

研究表明，不同品种油菜间土壤理化性质呈现差异性，土壤pH值、电导率、碱解氮、速效磷、速效钾和有机质因种植油菜品种的不同而发生相应的改变(P<0.05)。1样品pH值显著高于16-P22外样品，且1与16-P22外均与华5号和金油158样品无显著性差异；1和华5号样品电导率显著高于16-P22外和金油158样品，且16-P22外与华5号样品间无显著性差异；碱解氮16-P22外样品与华5号和金油158样品无显著性差异，但均显著高于1样品；16-P22外、华5号和金油158样品的速效磷和有机质含量均显著高于1样品，含量平均高61%和18.75%。1样品和金油158样品速效钾含量均显著高于16-P22外和华5号样品，且华5号样品速效钾含量最低。表1

表1 不同油菜品种土壤样品基本理化性质
Table 1 Basic physicochemical properties of different rapeseed soil samples

样品pH电导率碱解氮速效磷速效钾有机质SampleEC(us/cm)AN(mg/kg)AP(mg/kg)AK(mg/kg)SOM(g/kg)1 8.42a699.67a57.13b47.77b639.28a24.43b16-P22外8.26b559.67c64.13a78.43a600.85b 29.60a华5号8.31ab686.33b62.97ab74.19a559.49c28.82a金油1588.35ab558c62.38ab78.11a621.1a28.61a

注：同列不同小写字母表示样品间差异达显著水平(P<0.05)，下同

Note：Different letters within the same column mean significant difference among samples at 0.05 level.The same as below

2.2 OTU聚类

对4组油菜土壤样品进行16S rRNA基因序列分析，得到最终用于后续分析的优化序列178 320条，按照97%相似性对非重复序列进行OTU聚类，统计油菜土样的丰度信息得到OTU的代表序列6 468条。1、16-P22外、华5号、金油1 584组样品中包含的OTU数目分别为1 602、1 615、1 591、1 660。其中，金油158样品的OTU数目最多为1 660，华5号样品的OTU数目最少为1 591。4个样品共同包含的OTU数为1 083个，将4个样品进行两两比较发现，其中1与16-P22外共有的OTU为1 304个，1与华5号共有的OTU为1 287个，1与金油158共有的OTU为1 328，16-P22外与华5号共有的OTU为1 309个，16-P22外与金油158共有的OTU为1 351个，华5号与金油158共有的OTU为1 344个。而1、16-P22外、华5号、金油158中特有的OTU分别为100、82、76、90，1中特有的OTU数目最多，可能含有较多的特殊微生物种类。表2,图1

2.3 16S rRNA基因测序深度

研究表明,4个样品的稀释性曲线基本上已经趋于平缓，说明测序数据量基本合理，能够比较真实的反映这4个样品中的微生物群落，4组样品已经获得了绝大多数的样本信息，基本能够反映这4组土壤样品中微生物群落组成。图2

图1 OTU分布维恩
Fig.1 Venn diagram showing the distribution of OTUs

图2 OTU稀释曲线
Fig.2 Rarefaction curves of OTU

2.4 微生物多样性指数

研究表明，各品种油菜土壤样品Chaol和ACE指数间无显著性差异，且大小顺序为金油158>16-P22外>1>华5号，不同油菜品种土壤样品中金油158微生物群落丰富度最高，而华5号微生物群落丰富度最低， OTU聚类分析的结果也体现了这一结果的准确性。依据Shannon指数大小，将不同品种油菜土壤细菌群落多样性程度由高到低排列，依次为1、华5号、16-P22外、金油158，16-P22外和华5号间无显著性差异，均与1和金油158差异性显著；依据Simpson指数大小，不同品种油菜土壤细菌群落多样性程度由高到低排列，依次为1、16-P22外、华5号、金油158，其中16-P22外和华5号间无显著性差异，两者均与样本1和金油158有显著性差异。油菜品种1土壤样品Shannon指数最高，Simpson指数最低，说明其土壤细菌群落多样性最丰富；而油菜品种金油158土壤样品Shannon指数最低，Simpson指数最高，其土壤细菌群落多样性最少。表2

表2 样品Miseq测序结果及微生物多样性指数
Table 2 MiSeq sequencing results and the richness diversity indices for each sample

样品Sanmpie序列数ChaolACEShannonSimpsonCoverage1 48 6381 930±171a1 935±136a5.89±0.04a0.007 9±0.00c0.986 7 16-P22外45 8301 982±192a1 953±137a5.82±0.04b0.008 9±0.00b0.988 0 华5号39 4371 863±149a1 869±118a5.84±0.04b0.009 2±0.00b0.987 8 金油15844 4151 988±168a2 001±136a5.77±0.04 c0.011 3±0.00 a0.986 7

2.5 微生物群落结构

在门的分类水平上，相对丰度大于1%的门共覆盖了10个门，另外两个菌群，一个由于分类谱系低于置信阀值，没有得到分类信息，在统计学上被命名为“未分类”群，另一个被命名为“其他”群。研究表明，在所有4组土壤样品中，变形菌门(Proteobacteria)是含量最丰富的门，在1、16-P22外、华5号、金油158 4组样品中相对丰度分别为25.03%、24.27%、25.48%、24.86%，其次是放线菌门(Actinobacteria)，相对丰度分别为24.11%、23.32%、23.21%、18.62%，酸杆菌门(Acidobacteria)相对丰度分别为11.98%、12.10%、11.77%、12.76%，绿弯菌门(Chloroflexi)相对丰度分别为11.24%、9.07%、8.75%、8.45%。其余的菌门则占有较少的比例，比如硝化螺菌门(NitrosPirae)、蓝藻门(Cyanobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、芽单胞菌门(Gemmatimonodates)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、浮霉菌门(Planctomycetes)、“未分类”群和“其他”群。这个结果表明，在这4组样品土壤的菌类结构中，变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)和绿弯菌门(Chloroflexi)是优势类群，而剩余的细菌类群则为非优势类群。图3

图3 样品中门水平细菌群落结构及分布
Fig.3 Bacterial community structure and distribution of the samples at phyla

研究表明，共覆盖了34个属,其中24个属为未分类和未命名菌属，未知菌群(others)在各组样品中所占比例最高，分别占4组油菜土壤样品37.98%、6.02%、36.02%和35.64%。其中油菜土样1中优势菌属为Acidobacteria_norank(9.08%)、Euzebyaceae_norank(7.31%)、MSB-1E8_norank(7.83%)，16-P22外优势菌属为Acidobacteria_norank(9.37%)、Euzebyaceae_norank(7.77%)、MSB-1E8_norank(6.48%)，华5号优势菌属为Acidobacteria_norank(9.42%)、Euzebyaceae_norank(7.52%)、MSB-1E8_norank(7.34%)，金油158优势菌属为Acidobacteria_norank(10.37%)、Euzebyaceae_norank(6.31%)、MSB-1E8_norank(6.74%)。相对丰度大于1%的未知菌群主要属于未命名亚硝化单胞菌科(Nitrosomonadaceae_norank)、未命名Elev-16S-1332_norank、未命名放线菌纲(Actinobacteria_norank)、未命名芽单胞菌纲(Gemmatimonadetes_norank)、未分类放线菌纲(Actinobacteria_unclassfied)、MSB-1E8_norank、未命名尤泽比氏菌科(Euzebyaceae_norank)、未命名酸杆菌纲(Acidobacteria_norank)的菌群。其中4组油菜土壤样品中共有的Pontibacter属为耐盐性菌属，其相对丰度分别占1、16-P22外、华5号、金油158 4组油菜土壤样品中0.94%、1.67%、0.49%、0.72%，相对丰度大小顺序为16-P22外>1 >金油158>华5号。图4

图4 样品中属水平细菌群落结构及分布
Fig.4 Bacterial community structure and distribution of the samples at Species

2.6 样本间差异

研究表明，对4组土壤样品OTU进行主成分分析(PCA)，共提取3个主成分，第一主成分(PC1)、第二主成分(PC2)分别可以解释各维度的77.14%、14.94%，所以第1和第2主成分基本可以解释主要结果。16-P22外与华5号构成的微生物群落相似性最高，与1和华5号差异明显。图5

注：样本微生物群落组成越相似，PCA距离越近

Note ： The more similar the sample microbial community composition, the closer the PCA distance

图5 基于OTU单元的主成分(PCA)
Fig.5 Principal component analysis based on OUT level

注：EC：电导率；AN：碱解氮；AK：速效钾；AP：速效磷；SOM：有机质。(P<0.01)用**表示

Note：EC: electrical conductivity ;AN: available nitrogen ;AK: available potassium ;AP:available phosphorus ;SOM:(P<0.01) expressed by **

图6 Spearman系数门水平细菌丰度前10与土壤理化性质的相关性
Fig.6 Correlation between on Spearman’s rank correlations of the 10 dominant bacterial phyla and soil physicochemical properties

2.7 土壤理化性质与微生物群落之间的关系

研究表明，各样本土壤碱解氮含量、速效磷含量与浮霉菌门呈正相关(P<0.01)。土壤中碱解氮含量、速效磷含量与厚壁菌门呈负相关(P>0.01)。图6

3 讨 论

3.1 不同油菜品种间土壤理化性质的变化

张旭龙等[19]研究发现种植不同油葵品种均能降低盐碱地pH值，显著提高土壤碱解氮、速效磷和速效钾的含量。研究中在盐碱地上种植不同品种油菜可以降低土壤pH，提高土壤肥力，其他研究者的结果验证了这一点[10,20-21]，种植油菜对土壤有一定的改良效果，其中1对土壤速效磷含量提升最为显著， 16-P22外显著提高盐碱土壤速效磷、碱解氮和有机质的含量，这说明不同油菜品种对盐碱土壤理化性质要求不同，由于油菜根系具有活化固定氮、磷、钾功能[22]，因此,不同油菜品种根系分泌物可以影响土壤理化性质，使得土壤适合该品种的生长，进而导致了不同油菜品种土壤理化性质之间的差异。同时杨瑞吉[23-24]研究表明种植油菜可以提高土壤肥力水平，梅勇[25]研究发现在半干旱区的盐碱土壤上种植油菜也可以改善盐碱土壤的理化性质。

3.2 土壤微生物群落菌群结构及多样性

研究利用16S rRNA高通量测序技术对新疆石河子盐碱地种植油菜后的土壤样品进行测序分析。4组油菜土壤样品得到了最终用于后续分析的优化序列178 320条，用于物种分类的OTU 2 184条，共覆盖了30个门，68个纲、156个目、295个科、537个属。稀释曲线趋于平坦，说明获得了绝大多数的样本信息，基本能够反映这4个土壤样品中微生物群落组成。不同样品的微生物多样性指数(Ace 指数、Chao 指数、Shannon、Simpson 多样性指数))的变化也与OTU聚类分析表现一致。

土壤类型和植被覆盖类型对于微生物群落也有很大影响[26]。Zhibo等[27]研究西北地区复垦年限对于土壤细菌组成和多样性的影响中共获得了1 122 101条序列，被归为12个门，占优势的菌门包括变形菌门、放线菌门、芽单胞菌门、酸杆菌门、拟杆菌门、绿弯菌门和浮霉菌门。马飞等[28]研究锦鸡儿植物对于盐碱地影响中发现变形菌门等十种菌群，其中包括并不常见的广古菌门。这些微生物菌门绝大部分同样存在于研究中，说明相似的盐碱地环境下微生物群落的分布具有一致性。Ma B、Cheema S等研究[29-30]表明变形菌门为盐碱环境下最为常见的菌门，这在研究中的结果一致。目前大约有50个细菌属含有嗜盐和耐盐细菌，它们分别属于变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门和放线菌门[31]，其中Nitrospira属相对丰度大小为16-P22外>华5号>金油158> 1。萨如拉等[32]研究玉米秸秆还田对盐碱地土壤细菌多样性的影响中发现了Pontibacter属，此菌属具有耐盐特性[33]，而在研究中，Pontibacter属4个油菜品种样品相对丰度大小依次为16-P22外>1 >金油158>华5号，油菜品种16-P22外其根系相较于其它品种对于耐盐细菌的促生有一定作用，更适宜于生长在盐碱地环境中。郑贺云等[34]对新疆阿克苏地区盐碱地细菌类群多样性分析发现21个属，其中仅有芽孢杆菌属(Bacillus)与研究结果一致，其余菌属均未在研究土壤中没有发现。虽然土壤类型均为盐碱土壤，但是由于所处地区不同，盐碱化轻重不一样，植被覆盖类型不同，导致土壤微生物群落结构也会有所不同[35-37]。

3.3 土壤微生物群落与土壤理化性质及肥力之间的关系

土壤微生物作为植物多样性和陆地生态系统的生产力的重要驱动因素[38]，已有研究表明了土壤因子对于土壤微生物群落组成的重要性[39-40]。在研究中，物种与土壤碱解氮和速效磷呈显著相关。Liljeroth等[41]研究证明氮肥施用增加了细菌群落密度。氮是土壤微生物中关键限制因素，氮肥对于微生物群落具有重要的影响[42]。Ramirez等[43]研究发现放线菌种群与N呈正相关关系，在试验中碱解氮与放线菌之间无显著相关性，可能是由于荒地开垦一年内碱解氮对于放线菌没有影响，还需要后续进一步试验进行验证。土壤速效磷作为土壤中可被吸收的磷组分，可以影响土壤微生物磷的利用率，与土壤微生物密切相关[44]。牛世全等[45]研究发现速效磷与绿弯菌门、浮霉菌门、芽单胞菌门、放线菌门、拟杆菌门呈正相关，在研究中，速效磷仅与浮霉菌门呈正相关，与厚壁菌门呈负相关。Lei等[46]研究发现有效磷与厚壁菌门呈负相关，与研究中结果一致。

4 结 论

4.1 不同油菜品种间土壤理化性质有所差异。其中以油菜品种16-P22外在降低土壤pH、提高土壤碱解氮、速效磷和有机质方面表现最好；油菜品种金油158降低土壤电导率最低；油菜品种1对土壤速效钾含量提升效果最佳。

4.2 不同油菜品种土壤样本间shannon指数和simpson指数有显著差异，Chaol和ACE指数间无显著性差异，其中油菜品种16-P22外土壤微生物丰富度和多样性指数较高。

4.3 各样本土壤优势菌门类为变形菌门、放线菌门、酸杆菌门和绿弯菌门；土壤样本16-P22外Pontibacter属相对丰度较其它三个样品最高，该品种在盐碱土壤上有较好的适应性。碱解氮、速效磷是影响土壤微生物菌门丰度的主要因素。