糖尿病性脑内微小病变大鼠模型的建立及其病理学研究

张玉倩 刘笑迎 贾岩辉 王群 陈婡 王长德 曲红

1山东省滨州市中心医院神经内科 251700;2上海中医药大学附属上海市中西医结合医院神经内科 200082

脑内微小病变作为脑卒中发病的预测因子，对脑卒中的一级预防起至关重要的作用，也因此受到学者们的广泛关注[1]。脑内微小病变的提出源于扩大的血管周围间隙(VRS)，是指在头颅MRI的T2加权(T2WI)上见到的直径3 mm以下的边缘整齐、境界清楚、不伴有周围信号改变的影像学表现[2]。其病理改变包括脑梗死灶、陈旧性出血病灶、血管周围间隙、脱髓鞘、神经胶质化、纤维化、细胞浸润等[3]。糖尿病作为脑卒中的常见危险因素之一，与脑内微小病变的形成关系尤其密切[4]。糖尿病促进脑内微小病变的发病机制及病理改变暂不清楚。目前尚无脑内微小病变的动物模型，研究主要借鉴脑小血管疾病的动物模型。本研究旨在建立一个糖尿病性脑内微小病变的大鼠模型，并对其病理学改变进行分析。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 健康雄性1月龄Wistar大鼠共12只，由上海中医药大学实验动物中心提供，体质量80～90 g。采用随机数字表法分为正常对照组(n=6)和模型组(n=6)。

1.2 造模

1.2.1 糖尿病大鼠造模方法 参照赵宝珍等[5]改良的2型糖尿病模型建立方法，模型组给予高脂、高糖饮食饲养后，禁食12 h(不禁水)，应用电子称称取大鼠体质量，根据体质量临时配用所需1%链脲佐菌素 (溶于0.1 mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，冰浴中新鲜配制)，并置于冰盒中避光保存，按30 mg/kg腹腔注射。每周断尾取血测定一次非空腹血糖值，连续2次测量血糖值均>13.5 mmol/L定义为糖尿病模型成功。

1.2.2 糖尿病性脑内微小病变大鼠造模方法 糖尿病大鼠造模成功后每月给予低血糖诱导2次[6]。采用胰岛素腹腔注射诱导大鼠低血糖的方法，腹腔注射短效胰岛素(生物合成人胰岛素，诺和诺德公司，50 U/kg)。以微型血糖仪断尾法测量血糖，并记录所有大鼠腹腔注射胰岛素后每隔30 min的血糖值，直至达到目标血糖(2.0～2.64 mmol/L)。达到目标血糖后30 min再次监测血糖，并给予50%葡萄糖溶液5 ml皮下注射来终止低血糖，30 min后再次监测血糖。继续给予高脂、高糖饮食饲养。

1.3 头颅MRI筛查 饲养至6月龄对大鼠进行头颅MRI检查，以大鼠头颅MRI的T2WI上发现脑内微小病变≥6个而无脑梗死病灶出现定义为造模成功。MRI机器型号：3T imaging system (MAGNETOM Verio；Siemens Healthcare)。采用4通道相控大鼠线圈(Chenguang Medical Technologies Co，Ltd)，线圈型号：CG-MUC18-H300-AS。

1.4 脑组织准备及组织病理学评价 给予大鼠腹腔注射10%水合氯醛，过量麻醉后处死，在无菌条件下取大鼠脑组织。切取厚度为2～3 mm脑组织，置于多聚甲醛中固定48 h，石蜡包埋。冠状面连续切片(片厚4～7 μm)。

1.4.1 HE染色 石蜡切片脱腊后梯度乙醇水化，苏木素染色5 min，伊红染色1～2 min，二甲苯透明，中性树胶封片，光学显微镜下观察脑组织形态。

1.4.2 免疫组化 取石蜡切片进行免疫组化检测， 一抗为低氧诱导因子-1α(HIF-1α)抗体(1∶100，Abcam)，4℃孵育 16 h，加入广谱二抗，室温放置 30 min，随后 DAB 显色及苏木素染核，65℃烘箱烘干，二甲苯透明，中性树胶封片，镜下观察HIF-1α阳性细胞数目。

2 结果

2.1 血糖水平比较 糖尿病大鼠模型造模成功后，继续饲养至6月龄。至该时间截点模型组非空腹血糖水平为(20.75±3.42)mmol/L，正常对照组为(5.13±0.32)mmol/L，模型组较正常对照组明显升高(t=-11.141，P<0.01)。

2.2 每10 g血红蛋白吸光度 模型组为5.358 5±0.193 6，正常对照组为1.268 7±0.174 9，模型组显著高于正常对照组(t=-38.392，P<0.01)。

2.3 脑内微小病变数目 正常对照组及模型组均无脑梗死病灶。脑内微小病变较集中的部位为基底节和大脑皮层。

模型组脑内微小病变平均(10.00±2.76)个，最少6个，最多14个，6只大鼠脑内微小病变个数均≥6个。正常对照组脑内微小病变平均(2.33±1.37)个，最少0个，最多4个。模型组脑内微小病变数目多于正常组(t=-6.104，P<0.01)，见图1。

2.4 病理学改变 与正常对照组相比，模型组脑组织神经元数目减少，神经胶质细胞增生并肿胀，部分有微出血(图2，封3)。免疫组化显示，模型组脑组织镜下HIF-1α阳性表达细胞数为(2 324.47±255.15)个，正常对照组为(474.94±91.65)个，差异有统计学意义(t=-663.45，P<0.01)，见图3。

3 讨论

一直以来，糖尿病作为脑卒中的危险因素，以其特殊的卒中特点受到广泛关注。糖尿病伴发或并发脑卒中的发病率是正常人的2～3倍，且发病年龄较非糖尿病人群提前5年左右。其中以缺血性卒中多见，主要表现为多发的腔隙性脑梗死[7-9]。

近年来，脑内微小病变作为脑梗死的“预知因子”逐渐受到重视。在无症状的中老年人群及无脑梗死病史的人群中，脑内直径<3 mm的微小病变使其患脑梗死及脑梗死相关死亡的风险增加至少3倍[4]。其中基底节上部和皮质下白质的微小病变与糖尿病相关，糖尿病是脑卒中与脑内微小病变的共同危险因素[10]。因此，建立一种糖尿病性脑内微小病变的动物模型，为相关的动物实验研究及今后的临床研究打下基础，是十分必要而可行的。

本研究发现，采用每月两次低血糖法诱导，至糖尿病大鼠6月龄时可产生适用的糖尿病性脑内微小病变模型，模型组造模后出现脑内微小病变个数均≥6个，全部造模成功，提示在高血糖的基础上，反复低血糖损伤，在脑内微小病变的产生过程中起到了至关重要的作用。该过程中无大鼠死亡，是安全适用的造模方法。

造模成功后的病理结果显示大鼠脑组织神经元数目减少，神经胶质细胞增生并肿胀，部分存在微出血。免疫组化结果显示，HIF-1α阳性表达细胞数明显高于正常对照组，说明HIF-1α可能在糖尿病并发脑内微小病变的发病过程中起着举足轻重的作用。

既往研究显示，HIF-1α是缺氧或某些氧化应激状态下产生的诱导低氧基因表达和修复细胞内环境的调节因子[11-13]。在低氧环境下，HIF-1α诱导多种目的基因的表达，包括血管内皮生长因子、内皮素1、促红细胞生成素、诱导型一氧化氮合酶、核因子-κB等超过100个下游基因的表达。这些基因编码的蛋白参与了血管新生与重塑、神经再生、葡萄糖的转运及酵解、红细胞生成、氧化应激和炎性反应等多种病理生理过程。HIF-1α在脑微血管内皮细胞的破坏过程中起重要作用，缺血、缺氧后，可见脑微血管内皮细胞肿胀，空泡形成，部分细胞线粒体肿胀或空泡化，自噬体增多，核糖体脱落，甚至细胞核染色质固缩，最终导致血-脑屏障破坏[14]。

在高血糖基础上的反复低血糖损伤可诱导HIF-1α表达水平增加，提示糖尿病继发的缺氧和氧化应激机制参与了糖尿病性脑内微小病变的形成，在该基础上进一步发生了血-脑屏障破坏、血管损伤和重塑、神经元死亡、神经胶质细胞增生等改变。

由于目前尚无糖尿病性脑内微小病变大鼠的造模方法，本研究旨在为科研工作提供一种成功率较高的造模方法。本模型既可以用于研究糖尿病脑内微小病变的病理生理改变，也可以用于探索继发的脑实质病变。HIF-1α信号通路为进一步研究糖尿病性脑内微小病变的发病机制及治疗靶点提供了线索。然而，本研究也存在一定的局限性，所需的造模时间较长，可重复性仍需进一步探讨。在此基础上可进一步开展相关靶点的药物治疗，起到预防或治疗脑内微小病变的目的，进而预防脑卒中的发生。