利拉鲁肽对非酒精性脂肪肝大鼠肝脏组织中胰岛素JNK1信号通路的影响

张梅，石秀英，李林娟，薛亚妮

随着社会的进步，人们的饮食结构发生了巨大的改变，日常摄入的高脂高热量食物增多，使得非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)的发病率显著升高[1]。NAFLD的主要特征为肝细胞脂肪变性和脂肪蓄积，同时患者无过量饮酒史[2]。NAFLD 疾病谱包括单纯性非酒精性脂肪肝，严重患者会发展为非酒精性脂肪性肝炎或肝纤维化以及肝硬化，甚至发展为肝细胞癌[3]。胰岛素JNK1信号通路是激活炎性反应的主要影响因素之一。Smith等[4]研究表明：JNK1基因敲除可以减轻炎症及高脂饮食诱导的胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)和肝脂肪变，达到防止肝脏炎性反应和肝纤维化的效果。利拉鲁肽(liraglutide)是长效人胰高血糖素样肽-1 (glucagon like peptide-1，GLP-1)的类似物，与GLP-1具有同源性，由食物刺激小肠 L 细胞分泌[5-6]。相比其类似物GLP-1，利拉鲁肽有效半衰期延长，作用持久，不经过肝脏、肾脏降解排泄，使得利拉鲁肽备受关注。杨颖博等[7]研究表明：当机体出现高血糖时，利拉鲁肽能刺激胰岛素分泌，同时能够抑制胰高血糖素分泌；在机体出现低血糖时，利拉鲁肽能够减少胰岛素分泌。同时利拉鲁肽可以通过抑制食欲、延缓胃排空、增加饱腹感等多种机制抑制脂肪在肝脏堆积。本文旨在研究利拉鲁肽对NAFLD大鼠肝脏组织中胰岛素JNK1信号通路的影响，以期了解利拉鲁肽对NAFLD大鼠肝脏组织中胰岛素JNK1信号通路的作用机理，从而为NAFLD的治疗提供一定的理论依据。

1 材料

1.1 动物

选取40只6周龄SPF级大鼠，体质量170～230 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号SCXK(京)2017-0022，普通级，分8个笼子饲养，每个笼子5只。饲养于医学院动物中心实验室。

1.2 药物与试剂

利拉鲁肽(商品名：诺和力；批号：DP51077)购自丹麦诺和诺德公司；胰岛素受体抗体(货号：ab5500)购自Abcam公司；C-Jun氨基端激酶1抗体 (货号：CST3708)购自CST公司；磷酸化胰岛素受体底物1抗体(货号：CST9215)购自CST公司；磷酸化C-Jun氨基端激酶1抗体 (货号：CST2381)购自CST公司；β-actin抗体购自武汉华联科有限公司。

1.3 仪器

低温离心机购自湖南恒诺离心机有限公司；光学显微镜购自美国Thermo公司；721分光光度计购自美国sigma公司；恒温水箱购自上海信帆生物科技有限公司；切片机购自德国Leica公司；低温离心机购自湖南恒诺离心机有限公司；ADVIA 2400 全自动生化分析仪购自德国西门子公司；电子天平购自上海精天天平厂产品。

2 方法

2.1 建立模型

选取30只大鼠随机分为模型组、低剂量利拉鲁肽组和高剂量利拉鲁肽组，给予高脂饲料喂养，高脂饲料配方见表1；另设10只大鼠为对照组给予普通饲料喂养。持续18 d后，高脂饲料喂养的每组处死2只大鼠，根据朱晓宁等[7]研究得出的方法判断建立NAFLD大鼠模型是否成功。该实验经过动物伦理委员会批准同意。

表1 大鼠饲料成分表

2.2 分组及药物干预

根据建立模型时的处理方法上述大鼠被分为：对照组(control)、模型组(model)、低剂量利拉鲁肽组(low lira)和高剂量利拉鲁肽组(high lira)，其中模型组、低剂量利拉鲁肽组和高剂量利拉鲁肽组每组8只，对照组10只。低剂量利拉鲁肽组使用0.6 mg/(kg·d)剂量的利拉鲁肽腹腔注射，每日一次，次持续18 d；高剂量利拉鲁肽组使用1.2 mg/(kg·d)剂量的利拉鲁肽腹腔注射，每日一次，次持续18 d。

2.3 检测项目

2.3 1 一般情况的观察

准确称量大鼠体质量，处死大鼠后取其肝脏病监测器肝脏湿重并计算肝指数。肝指数=肝脏湿重/体质量×100%。

2.3.2 测定大鼠血清ALT、FBG、TG、TC和FINS变化

严格按照全自动生化检测仪使用方法检测大鼠血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、空腹血糖(FBG)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)和血清胰岛素(FINS)变化。

2.3.3 酶联免疫吸附法测定大鼠肝组织中TNF-α、SOD、MAD和FFAs含量

严格按照按照酶联免疫吸附法试剂盒测操作，测定大鼠肝组织中肿瘤坏死因子(TNF-α)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MAD)及游离脂肪酸(FFAs)含量。

2.3.4 Western blot 检测蛋白表达水平

按照Western blot 检测方法操作，使用蛋白质条带用扫描仪进行扫描，以β-actin为内参，应用Imagaquent 5.1软件对胰岛素受体(IR)、磷酸化胰岛素受体底物1(p-IRS1,Ser307位点)、C-Jun氨基端激酶1(JNK1)及磷酸化C-Jun氨基端激酶1(p-JNK1)蛋白质条带灰度进行相对定量分析。以目的蛋白条带与 β-actin 灰度比值表示蛋白相对表达水平。实验重复3次，取平均值为最终结果。

2.3.5 染色观察大鼠肝脏组织变化

将大鼠处死后取大鼠肝脏组织经过固定、冲洗、脱水、浸蜡、包埋、切片、贴片、烤片、脱蜡、染色、封片、烘干等步骤处理后，使用苏木精-伊红染色，毎张切片光镜下观察 5 个视野，在光学显微镜下观察大鼠肝脏组织病理学变化。

2.4 统计学方法

3 结果

3.1 大鼠体质量及肝指数变化

由表2可以看出，相比对照组，模型组大鼠体质量和肝指数显著增加，且两者差异有统计学意义(P<0.01)；相比模型组，利拉鲁肽组大鼠体质量和肝指数显著降低，且高剂量利拉鲁肽组显著低于低剂量利拉鲁肽组；两者差异有统计学意义(P<0.01)。

表2 大鼠体质量及肝指数变化检测

注：与对照组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.01

3.2 大鼠血清ALT、FBG、TG、TC和FINS含量检测

由表3可以看出，相比对照组，模型组大鼠血清ALT、TG、TC和FINS含量显著增加，且两者差异有统计学意义(P<0.01)，FBG含量无显著变化(P>0.05)；相比模型组，利拉鲁肽组大鼠血清ALT、TG、TC和FINS含量显著降低，且高剂量利拉鲁肽组显著低于低剂量利拉鲁肽组，两者差异有统计学意义(P<0.01)，FBG含量则无显著变化(P>0.05)。

表3 大鼠血清ALT、FBG、TG、TC和FINS检测

注：与对照组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.01

3.3 酶联免疫吸附法测定大鼠肝组织中TNF-α、SOD、MAD和FFAs含量

由图1可以看出，相比对照组，模型组大鼠SOD含量显著降低、TNF-α、MAD和FFAs含量显著升高，且两者差异有统计学意义(P<0.01)；相比模型组，利拉鲁肽组大鼠SOD含量显著升高，且高剂量利拉鲁肽组显著高于低剂量利拉鲁肽组，两者差异有统计学意义(P<0.01)；相比模型组，利拉鲁肽组大鼠TNF-α、MAD和FFAs含量显著降低，且高剂量利拉鲁肽组显著低于低剂量利拉鲁肽组，两者差异有统计学意义(P<0.01)。

3.4 大鼠肝脏组织中IR、p-IRS1、JNK1及p-JNK表达检测

由图2可以看出，相比对照组，模型组大鼠p-IRS1、JNK1及p-JNK蛋白表达显著升高，且两者差异有统计学意义(P<0.01)，IR表达无显著差异(P>0.05)；相比模型组，利拉鲁肽组大鼠p-IRS1、JNK1及p-JNK蛋白表达显著降低，且高剂量利拉鲁肽组显著低于低剂量利拉鲁肽组，两者差异有统计学意义(P<0.01)，IR表达无显著差异(P>0.05)。

3.5 HE染色观察大鼠肝脏组织病理学变化

由图3可以看出，对照组大鼠肝小叶结构完整且清晰，肝脏中央静脉大且壁薄，肝细胞呈放射状分布，且肝细胞呈多边形，大小一致且排列整齐，肝窦和核结构清晰可见。模型组大鼠组肝细胞肿胀，出现重度弥漫性肝细胞大泡性脂肪变，在肝细胞内部部分小叶内有坏死灶，且以淋巴细胞为主的炎症细胞出现浸润，部分出现点状坏死和灶状坏死。低剂量利拉鲁肽组和高剂量利拉鲁肽组肝细胞明显较高脂组肝细胞体积缩小，未见脂肪变性，肝小叶内未见炎症。

图1大鼠肝组织TNF-α、SOD、MAD和FFAs含量测定 与对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，##P<0.01

图2大鼠肝组织中IR、p-IRS1、JNK1及p-JNK表达检测 与对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，##P<0.01；A为对照组；B为模型组；C为低剂量利拉鲁肽组；D为高剂量利拉鲁肽组

4 讨论

IR与NAFLD的发病有着密切的关系， JNK1蛋白在在肥胖引起的IR中发挥了关键的作用[9]。邱涵等[10]研究证明：胰岛素信号传导时，胰岛素会和细胞表面胰岛素受体结合，使得胰岛素受体活化导致JNK1信号通路中的受体蛋白磷酸化。胰岛素受体底物主要有多种异构体，最重要的是IRS-1，这种异构体可以其介导胰岛素信号传导发生障碍并且使得使胰岛素作用的外周靶组织均发生IR。Nishina等[11]研究表明，JNKI活化介导了IRS1-中的Ser3O7磷酸化并且使得IRS-1对胰岛素信号转导的负调节作用，并且增加了胰岛素的敏感性。本实验中可以发现，在高脂饮食诱导的肥胖小鼠模型中胰岛素敏感组织脂肪等JNK活性明显升高，使用利拉鲁肽作用后大鼠JNK 1及p-IRS1显著降低，说明利拉鲁肽可以有效地抑制JNK信号通路，且抑制NAFLD的发生，这和石志平等[12]研究结论相一致。

图3大鼠肝脏组织病理学变化(HE，×400) A为对照组；B为模型组；C为低剂量利拉鲁肽组；D为高剂量利拉鲁肽组

目前诊断NAFLD的方法较多[13]，其中血清 ALT 水平是无创性诊断方法中重要的一种生化指标。霍琴琴等[14]研究表明，利拉鲁肽可以减轻高脂诱导的肝脂肪变同时降低肝组织炎症指标水平达到治疗NAFLD的作用。刘丽波等[15]临床研究证明，NAFLD患者使用 GLP-1类似物干预 12 周后，血清 ALT 水平明显下降。本实验中可以发现，模型组大鼠血清ALT含量显著升高，使用利拉鲁肽处理后，ALT含量显著降低，说明利拉鲁肽可以有效降低肝脏组织中的炎症，达到缓解和治疗NAFLD的作用。帖彦清等[16]研究表明，NAFLD患者中，由于肝内大量脂质沉积，使得过氧化产物如丙二醛(MAD)含量增加，并且会使得患者机体的抗氧化能力减弱，导致肝细胞膜和线粒体膜受损，引起血清丙氨酸转氨酶升高，同时也会使得大鼠的肝组织游离脂肪酸(FFAs)水平明显升高，诱发肝细胞死亡导致肝脏炎症反应和细胞功能障碍[17]。MAD的含量可以反映机体内发生脂质过氧化的程度，使自由基与生物膜中的多不饱和脂肪酸发生反应并使得氧化产物分解，由此可以得知MAD的含量可间接反映出细胞损伤的程度。本实验中可以看出，模型组大鼠体内MAD及FFAs含量显著升高，使用利拉鲁肽处理后MAD及FFAs含量显著降低，说明利拉鲁肽可以有效降低大鼠体内的氧化应激反应，且可以有效降低脂质氧化产物并降低肝脏细胞的炎症，达到缓解NAFLD的作用，与庞晓宁等[18]的结论一致。

综上所述，利拉鲁肽可以有效的抑制NAFLD大鼠肝脏组织中胰岛素JNK1信号通路并对肝功能起到保护作用，其作用机制可能与降低JNK1的表达以及抑制JNK1的磷酸化有关。但因NAFLD涉及到的信号通路及蛋白较多，在后续的实验中可以进一步探讨利拉鲁肽通过其他信号通路及蛋白的表达对NAFLD的治疗效果及作用机理。