Xpert MTB/RIF 检测结核分枝杆菌及利福平耐药性的应用价值研究

翁绳凤 李宁 邢俊蓬 张长海 郭威

结核病目前仍然是严重危及全球的一个公共卫生问题。近十年来，由于艾滋病的流行，移动和流动人口的增加，耐多药结核杆菌的增多，以及不少国家和地区对结核病控制的忽视等因素，全球结核病形势急剧恶化［1］。传统结核诊断技术不足是造成结核不能有效被控制的原因之一，世界许多地区结核病诊断仍然依赖不敏感、容易漏诊的涂片镜检法及耗时长的结核分枝杆菌培养法，从而导致延误诊疗［2］。因此亟需新诊断技术来弥补这些方法的不足。近年来，由美国Cepheid 公司研发生产的新型的分子检测方法-结核分枝杆菌/利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术（Xpert mycobacterium tuberculosis/rifampin，Xpert MTB/RIF），逐步受到国内外的广泛关注。2010年12月世界卫生组织（World Health Organization，WHO）正式推荐使用Xpert MTB/RIF 检测技术作为一种结核病快速诊断的新方法。该方法操作简单，快捷，全程检测只需2 h，而传统罗氏培养（Lowenstein-Jensen，LJ）需要4～8 周，时间长，无法满足临床需求。为了评估该技术结核病诊断效能，本研究通过对242 例临床诊断为肺结核患者的痰标本分别采用传统LJ 法和Xpert MTB/RIF 法进行检测，通过比对检测的敏感度、特异度探讨Xpert MTB/RIF 检测技术的临床应用前景。

1 材料与方法

1.1 病例来源

选取本院2016年1月至2017年7月期间住院且临床已诊断肺结核患者242 例，其中男性182例，女性60 例，年龄范围18～94 岁，平均（58.45±20.77）岁。病例诊断依据中华人民共和国卫生行业标准WS288-2017 肺结核诊断［3］：临床诊断病例在排除其他肺部疾病基础上符合以下6 种情况：①胸部影像学有活动性肺结核相符的病变，并具有相应的临床表现。②胸部影像学有活动性肺结核相符的病变，并获得任何1 种免疫学检查结果支持。③胸部影像学有活动性肺结核相符的病变，肺外组织病理检查证实为结核病变。④胸部影像学有活动性肺结核相符的病变，和支气管镜检查都符合气管/支气管结核。⑤符合结核性胸膜炎影像学改变，胸水为渗出液，腺苷脱氨酶（adenosine deaminase，ADA）高，并获得任何1 种免疫学检查结果支持。⑥儿童具有肺结核临床表现，符合结核病影像学改变，并获得结核菌素试验或γ-干扰素释放试验结果支持。对照组选取排除结核病以外的其他呼吸道疾病患者30 例，其中肺癌8 例，细菌性肺炎10 例，慢性阻塞性肺病9 例，支气管扩张3 例，疾病诊断标准参照《实用内科学》［4］。

1.2 仪器与试剂

Gene Xpert MTB/RIF 检测仪及试剂盒购自美国Cepheid 公司；改良罗氏培养基、药敏培养基及抗酸染液购自珠海贝索生物技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 分离培养和药敏试验

采用4%氢氧化钠处理法，用无菌操作方法将标本接种于改良罗氏培养基的斜面上，37℃，含5%～10% CO2温箱培养8 周。分别在培养第3 天和第7 天各观察一次，此后每周观察一次生长情况并记录。阳性结果随时报告。培养56 天后无生长判断为阴性结果。培养基上一旦出现菌落即进行抗酸染色确认是抗酸杆菌，然后进行菌种鉴定及药敏。所有操作参照《结核病实验室检验规程》［5］进行。药敏试验采用罗氏比例法：培养阳性者做药敏试验，参照《结核分枝杆菌药物敏感性试验标准化操作程序及质量保证手册》［6］，质控菌株为H37RV，来自北京市结核病防治所。

1.3.2 Xpert MTB/RIF 检测

每份样本需收集至少1 mL 痰液，在处理前采集好的痰标本需存放在2℃～8℃。根据《结核病实验室检验规程》［5］的操作方法进行痰样本处理。将前处理管在漩涡振荡器上震荡20 s 直至无可见块状痰标本存在。取2 mL 处理后样本由加样孔缓慢加入Cartridge 反应盒内，将反应盒放入Gene Xpert 检测系统进行检测，2 h 后系统自动显示MTB 和RIF 检测结果。MTB 阳性的诊断标准为5个探针中至少2 个探针Ct 值≤38，并可进一步按照Ct 值对样本中MTB 进行半定量分析，Ct 值＜16 为髙荷菌量，16～22 为中等荷菌量，22～28 为低荷菌量，＞28 为极低荷菌量［7］。检测利福平耐药的基础在于MTB 特异性分子信标ΔCt 值，系统设置的结果判断标准为［7］：ΔCt＞3.5 提示对利福平耐药，ΔCt≤3.5 提示对利福平敏感。

1.4 统计学处理

采用SPSS 17.0 软件进行数据分析，计数资料以%表示，采用χ2检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Xpert MTB/RIF 对痰标本MTB 的检测结果

242 例肺结核患者中，Xpert MTB/RIF 检测MTB 敏感度为54.96%（133/242），特异度为100%（30/30）。利福平耐药检出率为24.06%（32/133）。见表1。

表1 Xpert MTB/RIF 对痰标本MTB 检测分析［（n，%）］Table 1 Sputum MTB analysis by Xpert MTB/RIF［（n，%）］

2.2 Xpert MTB/RIF 检测技术与LJ 培养法检测MTB 结果比对

以临床诊断为金标准，Xpert MTB/RIF 法阳性率54.96%（133/242），LJ 培养法阳性率40.5%（98/242）。以固体培养为金标准，Xpert MTB/RIF检测MTB的敏感度为86.73%（85/98），特异度为64.60%（93/144）。2 种方法阳性率差异有统计学意义（χ2=59.712，P=0.000），2 种方法结果符合率为73.55%（178/242）。对Xpert MTB/RIF 和固体培养进行Kappa 检验，K=0.751，两者具有好的一致性。2 种方法联合检测，总阳性率60.33%（146/242）。见表2。

2.3 Xpert MTB/RIF 检测技术与LJ 药敏法检测利福平耐药结果分析

表3结果中，Xpert MTB/RIF 检出利福平耐药21 例，耐药率24.71%（21/85）；LJ 法检出利福平耐药20 例，耐药率23.53%（20/85）。2 种方法对利福平耐药性的检出率无统计学差异（χ2=0.033，P=0.869）。2 种方法利福平耐药性检测符合率为98.82%（84/85）。

表2 Xpert MTB/RIF 与LJ 培养检测MTB 结果对比分析Table 2 Comparison of Xpert MTB/RIF and LJ culture in detection of MTB

表3 Xpert MTB/RIF 与LJ 药敏法检测利福平耐药性结果对比分析Table 3 Comparison of Xpert MTB/RIF and conventional drug susceptibility on Rifampicin

3 讨论

肺结核是通过肺部感染结核分枝杆菌而导致的疾病，大多数结核菌存在于肺部病灶坏死组织，然后通过痰液将结核菌排除体外。所以，是否从痰液检出结核菌通常作为依据来诊断患者是否患有结核病。目前传统的固体培养法阳性率只有30%～40%［8-11］，特异度差，各种分枝杆菌均可生长，需要结合分枝杆菌菌种鉴定方可确定是否为结核分枝杆菌。抗酸染色涂片结核菌数目需＞5 000 条/mL 才能得到阳性结果［12］。而Xpert MTB/RIF 检测技术在痰标本中的检测极限为131 CFU/mL，灵敏度远高于涂片检测［10］并且Xpert 技术具有操作简便，生物安全性高，检测过程不易受干扰等特点［13］。

国内报道的对Xpert MTB/RIF 检测技术的评估，其研究对象大多是成年人或儿童，对老年人群该技术的应用评估报道不多［14］。本实验在一家三级老年综合医院进行，老年人群有其特殊性，常存在合并多种基础疾病，结核症状不典型，咳痰困难等问题，需要更为敏感的检测方法早期诊断。本次研究对象是临床诊断肺结核患者，应用Xpert MTB/RIF 检测痰液中的MTB 及利福平耐药性，并与传统罗氏培养方法进行比对来评价它在老年综合医院中肺结核诊断的敏感度和特异度。

近年来国内外对此项技术做了许多研究，针对不同的检测标本它的敏感性和特异性显示不同差异。一项多中心研究结果显示Xpert MTB/RIF诊断结核病的特异度达99.2% ，灵敏度为92.2%，对利福平是否耐药检测的正确率约98%［15］。HU等［16］研究显示痰培养阳性患者中Xpert 的灵敏度为94.5%，特异度为99.8%。赵冰等［17］研究发现，以临床诊断为参考标准，痰Xpert 灵敏度为58.82%，特异度为99.68%。本次研究也显示，在临床诊断肺结核病例中，它检测敏感度为54.96%，高于黄建斌［18］和赵冰等［17］研究结果（48.05%和45.45%）。说明Xpert MTB/RIF 检测技术在检测不同标本时，敏感度存在差异，但都显示很高的特异度。但以罗氏培养结果为金标准，Xpert MTB/RIF检测MTB 的敏感度和特异度明显低于王怡心等学者［13］的研究，原因可能与痰的质量有关。试验中大多数是老年患者，不能正确咳痰，有的标本是口水，严重影响检测结果。所以，对于老年人，一次阴性结果不能排除结核病的可能，多次检测并引导正确留痰才能提高阳性率。

利福平作为重要抗结核药物，耐药现象严重，并且对利福平耐药的90%菌株同时对异烟肼耐药，因此检测利福平耐药性可作为多重耐药结核杆菌（multidrug resistant tuberculosis，MDR-TB）的筛选标志［19］。Boehme 等［15］研究结果显示，与比例法药敏试验结果相比，Xpert MTB/RIF 能够正确判断97.6%的利福平耐药菌株和98.1%的利福平敏感菌株。本研究中2 种方法检测利福平耐药性的符合率也达到98.82%。30 例非结核患者Xpert MTB 全部阴性，提示该方法的高特异度，与其他学者［20-21］研究结果（97.5%和98.8%）相似，说明对老年人群也具有高特异性。但本研究未建立与中青年的比对，不能充分说明该技术在老年人群中的检测特点。另外，2 种方法联合检测结核分枝杆菌提高了单一方法的灵敏度，对结核病早期诊断有更大的意义。

当然Xpert MTB/RIF 也存在些自身的问题及局限性，比如，对痰质量的要求，也不能区分死菌或活菌，但它作为一种快速、直接可靠、高灵敏度和特异度地检测结核病患者以及是否对利福平耐药的新诊断技术，可更快的帮助临床从病原学上检出结核病患者，提高确诊率。同时该检测设备仅需要2 个独立区域，更多的基层实验室能达到这种低设施要求，有助于基层结核病患者较早的得到准确的诊断，充分的治疗和患者管理［22］。因此，建议在实验室条件不高的地区推广使用。