LASP-1蛋白在非小细胞肺癌中的表达及与其临床病理特征的相关性分析

李君强 蒋茂芬 唐晶晶 王敏 刘春姣 肖维华 马海芬

肺癌发病率在世界恶性肿瘤中排名第一，死亡率也位居首位，是一个严重影响居民健康和生活质量的公共卫生问题［1］。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌中最为常见类型，所占比例约为80%～85%［2-3］。手术治疗是早期NSCLC 治疗的首选有效手段，而治疗失败原因主要原因为晚期转移及恶性程度较高等。曾有国内外研究报道，肿瘤转移是多步骤、多因素参与的生物学过程，其中细胞迁移为肿瘤转移的首要步骤，而细胞肌动蛋白骨架重构是细胞运动的第一步，故认为肌动蛋白的表达与肿瘤细胞的转移有着一定的联系［4-5］。LASP-1 蛋白是近年来发现的一种新的肌动蛋白结合蛋白和斑粘连结合蛋白支架蛋白，与肿瘤侵袭转移有着密不可分的关系［6］。曾有研究报道，LASP-1cDNA 最早由乳腺癌转移性淋巴结的cDNA 文库中筛选克隆而得到［7］。而在近年研究报道中证实，LASP-1cDNA 在肝癌、食管鳞癌、肾透明细胞癌、胃癌及胆囊癌组织中表达异常较为多见，关于其在NSCLC 中的表达及其作用机制尚未明确［8］。本文旨在探讨LASP-1 蛋白在NSCLC 癌组织中的表达及与其临床病理特征的相关性，分析LASP-1 蛋白在NSCLC 发生和进展中的作用机制。

1 资料与方法

1.1 临床资料

随机选取2014年1月至2018年5月在本院就诊的102 例NSCLC 患者作为研究对象，其中男61例，女41 例，年龄为48～80 岁，平均年龄为（58.36±5.64）岁。纳入标准：①所有患者均符合临床上NSCLC 明确诊断标准［9］；②所有患者完善准备后均行手术治疗且术中及术后均行病理学检查确诊；③所有患者知情同意本研究并签署知情同意书。排除标准：①存在手术禁忌症者；②除NSCLC外存在其他恶性肿瘤者；③存在原发性肝肾、功能障碍者；④临床病例资料不完整或缺乏准确性者。

1.2 研究方法

收取102 例NSCLC 患者中肺鳞状细胞癌与腺癌组织共102 份（观察组），另收集肺癌旁组织形态学正常的肺组织（距离肿瘤5 cm 以上）102 份（对照组），2 组组织标本均采用免疫组化EnVision 法进行LASP1 蛋白水平的检测。

1.2.1 检测所需试剂/仪器

免疫组化试剂盒（H.SABC，SAl082）购于武汉博士德生物工程有限公司；自动切片机购自德国LECIA 公司；显微摄像仪（BX60 型）购自日本Olympus 公司；Simply P 总RNA 提取试剂盒购自杭州博日科技有限公司；RT-PCR 试剂盒（批号AK2801）购自于日本TaKaRa 公司；荧光定量PCR仪（PRISM7700）购自美国应用生物系统（ABI）公司；LASP-1 一抗体购自上海慧颖科技有限公司；磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）由本医院提供，山羊抗兔/鼠二抗购自上海睿铂赛生物科技有限公司。

1.3 免疫组化检测方法

采用Envision 法检测：所有标本组织石蜡切片厚度为4 μm，裱片后60℃烘烤2～4 h；二甲苯2 次及酒精梯度脱蜡至水；置切片于1.5%甲醇过氧化氢液（室温10 min）阻断内源性过氧化物酶，将切片取出用自来水冲洗干净，置切片于pH 值为9.0的乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）修复液进行抗原修复（煮沸20 min，室温冷却20 min）；将切片用自来水清洗干净，依次入蒸馏水1 次、磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）3 次；将切片放于孵育盒上滴加正常非免疫山羊血清；将血清清除后，滴加1∶600 浓度的LASP-1 一抗（来源于英国Abcam 公司）4℃孵育过夜，对照组采用PBS 代替一抗；次日取出切片置于自来水、蒸馏水1 次、PBS 3 次清洗切片；滴加山羊抗兔/鼠二抗（DAKO）室温孵育30 min；二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色，苏木精复染，酒精梯度脱水，二甲苯透明，最后中性树脂封片。

1.4 资料收集与染色结果判读

记录所有患者性别、年龄、肿瘤大小、病理类型、分化程度、浸润深度、TNM 分期系统（tumor node metastasis，TNM）分期以及淋巴结转移情况和不同组织标本中LASP-1 蛋白的表达水平，并比较不同组织中LASP-1 蛋白表达水平的差异。LASP-1 蛋白结果评定方法［10］：每个标本随机选取10 个高倍视野（×100）的阳性细胞百分比计算，以其平均值作为评定依据。阳性染色为淡黄色、棕褐色或棕黄色，呈团块状或颗粒状。专业技术人员根据染色强度进行评分［11］：3 分为棕褐色，2 分为棕黄色，1 分为浅黄色；0 分为无色；根据阳性细胞所占比例评分：全阴性为0 分，阳性细胞＞75%为4 分，51%～75%为3 分，11%～50%为2 分，≤10%为1分。二者评分的乘积≥2 分者则判断为LASP1 蛋白阳性，二者评分的乘积＜2 分者为阴性。将已知阳性切片作为阳性对照。

1.5 统计方法

均采用SPSS 18.0 软件进行统计分析，计数资料通过率或构成比表示，并采用χ2检验，以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 2 组组织标本中LASP-1 蛋白表达情况比较

NSCLC 患者癌组织中LASP-1 蛋白的阳性表达率显著高于癌旁正常组织，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表1；且LASP-1 蛋白在NSCLC 癌旁正常组织细胞浆中表现为无色，而在肺鳞状细胞癌和肺腺癌癌组织细胞器细胞浆中表现为棕褐色，见图1A～C。

表1 2 组组织标本中LASP-1 蛋白表达情况比较Table 1 Comparison of LASP-1 protein expression in tissue samples from the 2 groups

图1 LASP-1 蛋白在不同组织中的表达情况Figure 1 Expression of LASP-1 protein in different tissues

2.2 不同临床病理特征的NSCLC 患者其LASP-1蛋白表达情况比较

不同性别、年龄、肿瘤大小和病理类型的NSCLC 患者其LASP-1 蛋白阳性表达率无差异（P＞0.05），但肿瘤低分化、TNM 分期Ⅲ期+Ⅳ期，浸润深度T3+T4、以及出现淋巴结转移的NSCLC患者其LASP-1 蛋白的阳性表达率显著较高（P＜0.05），见表2。

3 讨论

目前临床上对于NSCLC 的治疗主要以手术为主，但分析大量病例资料可知同样病理类型和分期的NSCLC 患者予以相同标准化治疗后，其预后效果仍存在着一定的差异。有研究显示不同病理类型的预后差异可能与肿瘤病灶的侵袭与转移有关［12］。根据既往文献的报道，细胞中的LASP-1蛋白主要定位在胞浆［13］。但也有研究报道LASP-1 可存在于胞核中［14］。本研究结果中，LASP-1 蛋白主要存在于细胞浆中，与既往研究结果一致［15］。曾有文献报道，肿瘤的TNM 分期和淋巴结转移均为影响NSCLC 患者远期预后生存的主要因素［16］。而临床分期仍旧为目前临床上NSCLC诊治的主要依据［17］，故及时明确肿瘤病灶是否侵袭和转移是评估患者预后的重要手段。

本研究结果显示，NSCLC患者癌组织中LASP-1蛋白阳性率表达显著高于癌旁正常组织，可提示，LASP-1 蛋白与NSCLC 的发生可能有着一定的联系。另一方面，本组数据显示，不同性别、年龄、肿瘤大小和病理类型的NSCLC 患者其LASP-1 蛋白阳性率的表达无明显差异，但肿瘤低分化、TNM 分期Ⅲ期+Ⅳ期，浸润深度T3+T4、以及出现淋巴结转移的NSCLC 患者其LASP-1 蛋白的阳性表达率均显著升高。进一步表明，LASP-1 蛋白的表达水平与NSCLC 的恶性程度、分期以及病灶的侵袭、转移等均有着密不可分的关系。结合以往生物学研究可知，LASP-1 基因染色体定位于17q11-q21.3［18］。LASP-1 蛋白中的SH3 和LIM 结构域均在蛋白质-蛋白质相互作用中起着极为重要的作用，。其中SH3 结构领域可与palladin 蛋白、脂肪瘤多见融合伴侣、前白介素-16 和血管扩张刺激磷蛋白和斑联蛋白等进行相互结合，从而起到一定的作用。曾有不少国内外研究报道，LASP-1 蛋白在机体组织中可通过SH3 结构域对细胞伪足形成、延伸和侵袭起着一定的促进作用［19］。故对于分化程度越低，浸润程度越深以及出现淋巴结转移的患者其LASP-1 蛋白表达更高。而Krp1 蛋白是一种涉及伪足延伸和细胞运动粘着斑蛋白。相关研究显示，中的LIM 结构域可与Krp1 蛋白相互作用，故在NSCLC 癌组织中，LASP-1 蛋白表达的升高可促使LIM 结构域与LASP-1 结合共同定位于膜联整合素CD44 和衔接蛋白Ezrin［20］。CD44与Ezrin 蛋白均介导细胞与细胞外基质接触，参与细胞内信号转导，进而促进肿瘤细胞的增殖生长。近年来，随着病理学研究的不断深入，有研究报道显示，LASP-1 蛋白与口腔鳞癌细胞的增殖和迁移能力有关，参与了肿瘤的进展和侵袭过程［21］。对肝癌、食管鳞癌、肾透明细胞癌、胃癌及胆囊癌研究亦发现LASP-1 蛋白高表达可促进肿瘤细胞的生长、迁移和浸润能力［22］。而本组数据结果也表明，肿瘤分化越低、分期越高以及出现周围组织浸润转移的NSCLC 患者其LASP-1 蛋白表达水平更高。由此可见，LASP-1 蛋白与恶性肿瘤细胞的增殖生长有着一定的联系。

表2 不同临床病理特征的NSCLC 患者其LASP-1 蛋白表达情况比较［（n，%）］Table 2 Comparison of LASP-1 protein expression in NSCLC patients with different clinicopathological features［（n，%）］

综上所述，LASP-1 蛋白在NSCLC 患者癌组织中表达水平较高，且与肿瘤分化程度、TNM 分期、浸润深度和淋巴结的转移有着密切联系。因此，LASP-1 蛋白表达水平的增加可能参与促进NSCLC 肿瘤病灶的侵袭和转移。