循环肿瘤细胞（CTC）在乳腺癌预后与化疗评估中的应用

梁志洪 陈结贞 陈永雪 古文鑫 吴泽华

乳腺癌是女性肿瘤患者最常见的恶性肿瘤之一，好发于50～54 岁，不论在发达国家还是发展中国家，乳腺癌已成为女性恶性肿瘤致死的首要原因［1］。据统计约90%肿瘤导致的死亡是由于复发转移引起［2］。而目前，对乳腺癌转移过程认识的主流观点仍是“种子-土壤”学说，即肿瘤细胞自原发灶脱落，直接或经淋巴系统间接进入血循环系统形成循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC），进而在远处组织、器官增殖，最终形成转移灶［3］。CTC 是指从癌症原发部位脱落，通过血管或淋巴系统进入血液循环的细胞［4］。在乳腺肿瘤发生的早期CTC 侵入血液循环系统中，随着肿瘤的进展CTC 在远处进一步形成转移灶，故CTC 在乳腺癌转移过程中发挥着重要作用。现今以乳腺癌为代表的CTC 研究已取得了快速发展，CTC 可反映肿瘤的负荷状态及转移情况，及时评估患者的治疗效果［5］。研究发现CTC 在乳腺癌早期诊断、分期等方面已经展示出良好的应用前景［6］。本研究将通过检测患者外周血CTC，探讨CTC 在评估患者病情及化疗评估效果中的应用，为乳腺癌的病情评估、转移评估和化疗疗效评估寻求有效的检测方法。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2009年1月至2014年1月于本院乳腺甲状腺外科进行治疗的女性乳腺癌患者135 例，患者年龄范围在31～74 岁，平均年龄43.2 岁，其中绝经前75 例，绝经后60 例。纳入标准［7］：①经空芯针穿刺活组织检查确诊为乳腺癌；②所有患者为TNM 分期系统（tumor node metastasis,TNM）Ⅰ～Ⅳ期乳腺癌；③年龄20～80 岁，无化疗禁忌证并签署知情同意书；④肿瘤为单侧、单发，就诊前均未接受任何辅助性治疗；⑤无其他部位恶性肿瘤病史。排除标准：①炎性乳腺癌；②哺乳期乳腺癌；③患者入院前已行包块切除活组织检查。随访：纳入的患者，从第一诊疗后开始进行随访工作；随访内容包括患者的患者一般情况，肿瘤的彩超复查，CTC 检测复查；随访时间：患者第一次诊疗后，每隔3 个月进行随访，时间期限5年；终止随访：达到随访时间期限，或患者失联，或患者意外死亡；随访方式：电话随访。本实验研究方案获得本院伦理委员会批准（医研伦审2014年第46 号）。

1.2 膜过滤法（isolation by size of epithelial tumor cells，ISET）检测CTC

取患者首次化疗前和化疗后健侧上肢浅静脉血5 mL（弃去最初抽取的2 mL 血液，排除皮肤上皮组织污染），颠倒混匀后在2 h 内按照标准ISET检测流程进行CTC 检测［8］。将5 mL 全血应用含0.2%甲醛的缓冲液稀释至8 mL，将固定好的样本转移至自动化检测平台CTCBIOPSY®（武汉友芝友医疗科技股份有限公司）中（预先装有8 μm 的滤膜），上机检测，进行过滤、漂洗、样本染色、清洗等自动化操作。检测完成后取出滤器，取下滤膜，置于载玻片上，干燥后封片，于光学显微镜下观察结果。

1.3 CTC 评判标准

根据ISET 法［8］检测CTC 的判读标准进行阅片并统一判读：①细胞核大小不均匀；②细胞核直径＞18 μm；③细胞核存在异型性；④染色质存在三维层次；⑤高核质比。将以上5 种情况中至少存在4 种的细胞定义为CTC。检测到1 个CTC 即为检测阳性。

1.4 统计学方法

采用SPSS 18.0 统计软件进行分析。患者临床病理特征如年龄、绝经状态等计数资料采用χ2检验进行比较；生存分析比较采用Mantel-Cox 检验；化疗前后CTC 阳性率差异的比较采用McNemar 检验。P<0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 CTC 与乳腺癌临床因素相关性分析

2.1.1 CTC 与乳腺癌TNM 分期相关性分析

如表1所示，乳腺癌患者中CTC 阳性率与肿瘤TNM 分期显著相关（P<0.05），TNM 分期为Ⅰ期的患者CTC 阳性率为7.7%，而在TNM 分期为Ⅳ期患者中CTC 阳性率为73.8%；TNM 分期Ⅳ期的CTC 阳性率远高于Ⅰ期的阳性率，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

2.1.2 CTC 与乳腺癌标志物相关性分析

如表1所示，人类表皮生长因子受体2（humanerbB-2，HER-2）与增殖细胞核抗原Ki-67（antigen Ki-67，Ki-67）表达亦与CTC 阳性率明显相关，在HER-2 阳性与Ki-67 高表达的患者中CTC 阳性率分别为71.2%和68.8%远高于HER-2 阴性与Ki-67低表达患者的34.8%和29.1%，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

2.1.3 CTC 与雌/孕激素受体相关性分析

如表1所示，在雌激素受体（estrogen receptor，ER）和孕激素受体（progesterone receptor，PR）阳性的乳腺癌患者CTC 阳性率52.1%和51.8%；而在ER 和PR 阴性的乳腺癌患者中CTC 阳性率分别为53.7%和54.0%，可见CTC 阳性率与ER 及PR 表达无显著相关性（P＞0.05）；此外CTC 与患者绝经状态亦无明显相关，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 不同CTC 组患者预后生存分析

根据化疗前CTC 阳性情况，将乳腺癌患者分为2 组：CTC 阳性组71 例和CTC 阴性组64 例。其中CTC 阳性组总生存率为36.73%，CTC 阴性组总生存率为59.37%，CTC 阳性组总生存率低于CTC阴性组总生存率，差异具有统计学意义（P＜0.05），见图1。

2.4 乳腺癌患者化疗前后CTC 检出情况差异

化疗前乳腺癌患者CTC 阳性率为52.5%（71/135），而化疗后乳腺癌患者的CTC 阳性率显著降低至20.0%（27/135），差异具有统计学意义（P＜0.05），见表2。

3 讨论

乳腺癌是好发于女性群体的常见恶性肿瘤，其发病率在女性恶性肿瘤中居首位［9］。目前综合治疗模式使乳腺癌的复发率和死亡率均显著降低，但其仍然是导致女性死亡的主要原因之一，其中复发和转移是导致乳腺癌患者死亡的最主要的原因［10］。现阶段临床应用肿瘤影像学特征来预测患者的复发和死亡风险，如原发肿瘤大小、肿瘤局部转移及远处转移等情况。但肿瘤影像学特征对早期评估肿瘤转移的情况具有一定局限性，为进一步评估与提高乳腺癌治疗的疗效，需寻找更有效的疗效和预后检测指标。

表1 CTC 阳性率与临床病理因素的相关性［n（%）］Table 1 Correlation between positive rate of circulating tumor cells and clinicopathologic factors［n（%）］

图1 不同CTC 组患者生存分析Figure 1 Survival analysis of patients in different CTC groups

表2 乳腺癌患者化疗前后CTC 检出情况差异（n）Table 2 Differences in CTC detection before and after chemotherapy in breast cancer patients（n）

CTC 是远处转移灶形成的重要前提和基础，故CTC 的检测有助于早期评估肿瘤的转移情况［11］。然而由于循环肿瘤细胞存在于外周血中而不易被检，ISET 法、逆转录PCR（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）、Cell Search系统、流式细胞术等陆续被研发用于CTC 检测［12］。其中ISET 法原理是利用CTC 与正常细胞大小的差异，将外周血通过8 μm 孔径的滤膜过滤后，再应用形态学方法鉴别肿瘤细胞，以确定CTC阳性情况。吴源娜等［13］应用ISET 技术分离34 例胃癌晚期患者外周血循环肿瘤细胞（CTC），并发现ISET 法的CTC 捕获技术具有较高的检出率，胃癌组CTC 阳性率为23.5%（8/34），对照组均未检出CTC。然而基于ISET 法CTC 检测技术在乳腺癌中的应用较少，本研究中将采用ISET 法检测乳腺癌CTC 情况。

在本研究结果中，CTC 阳性5年总生存率为36.73%，CTC 阴性组5年总生存率为59.37%，CTC阳性组总生存率低于CTC 阴性组总生存率，差异具有统计学意义（P＜0.05）。此结果与此前Cellsearch 检测CTC 在转移性乳腺癌预后评估结果相一致［14］。Bidard 等［14］应用Cell search 检测乳腺癌CTC 情况，结果发现当患者CTC＞5 个/7.5 mL（CTC 阳性）其总生存期显著小于CTC 阴性患者（CTC＜5 个/7.5 mL）。Jiang 等［15］通过在294 例中国乳腺癌患者中检测CTC，其结果证实了CTC 阳性状态均是总生存期和无进展生存期独立预测因素。本实验结果进一步验证了通过CTC 阳性率可以预估乳腺癌患者预期生存率，在CTC 检测阳性的患者中肿瘤复发概率较高，生存期短，预后差。为进一步分析CTC 检出情况与患者临床病理特征的关系，本研究发现CTC 阳性率与HER-2 及Ki67表达情况有关，但与患者ER、PR 表达情况无关。在HER-2 与Ki-67 表达阳性的患者中CTC 阳性率分别为71.2%和68.8%远高于HER-2 与Ki-67 表达阴性患者的34.8%和29.1%，差异具有统计学意义（P＜0.05）。这可能与HER-2 高表达的肿瘤侵袭力强，恶性程度高［15-16］，Ki-67 高表达患者癌细胞增殖更加活跃有关［17-18］。尽管在HER-2 阳性患者中CTC 阳性率高，但是这并不代表HER-2 阳性患者检出的CTC 细胞依然呈现HER-2 阳性。Ligthart等［19］报道，在HER-2 阳性的乳腺癌患者中，其检出CTC 细胞仍有29%呈现HER-2 阴性。其结果说明原发病灶与CTC 的HER-2 表达情况存在不一致性，并进一步提示笔者深入探讨CTC 细胞的分子分型与乳腺癌患者预后研究。而乳腺癌患者CTC阳性率与患者绝经状态、ER 和PR 表达无显著相关性（P＞0.05）。此外，本研究亦发现化疗前乳腺癌患者CTC 阳性率为52.5%（71/135），而化疗后乳腺癌患者的CTC 阳性率显著降低至20.0%（27/135），差异具有统计学意义（P＜0.05）。此结果与Helissey 等［20］应 用Cellsearch 检 测 结果相一致，CTC 阳性乳腺癌患者（CTC＞5 个/7.5 mL）化疗后复查CTC 转为阴性或计数值下降超过70%，并进一步证实CTC 检测可以用于乳腺癌患者在化疗期间的疗效检测，辅助判断化疗疗效及患者生存预后分析。

综上所述，本研究结果初步显示CTC 数目的变化与患者肿瘤TNM 分期及HER-2，Ki-67 表达相关；CTC 可以用于估计乳腺癌患者预后生存率；且CTC 的数目变化与化疗前后状态有一定的关系，化疗后CTC 阳性率明显降低，CTC 能够在一定程度上反映化疗的疗效。然而本研究中存在部分CTC 检出阴性的患者，这对结果存在一定影响。同时，本研究样本量较少，因此CTC 在化疗的疗效评估中的作用价值仍需前瞻性、大样本、多中心的临床研究进一步验证。