α-亚麻酸通过提高培养基抗氧化能力促进绵羊卵母细胞体外核成熟

张 博，努日比娅姆·麦麦提托合提，宋玉坤，郜 宇，王旭光，阿布力孜·吾斯曼

（新疆农业大学动物科学学院，新疆乌鲁木齐 830052）

体外成熟的卵母细胞存在细胞质成熟差或者细胞核质成熟不同步等问题，导致体外生产的胚胎卵裂率、囊胚率和妊娠率低。卵巢卵泡作为卵母细胞的生长和成熟发生的场所，卵泡液的生化成分决定着卵母细胞生长和成熟的微环境。多不饱和脂肪酸（PUFA）在卵母细胞成熟和早期胚胎发育过程中除了能量供应，还是合成前列腺素（PG）的直接前体。作为ω-3 PUFA，α-亚麻酸（ALA）是哺乳动物2 种必需脂肪酸之一，也是生物体组织生物膜的结构材料。ALA 可以增加牛卵母细胞内环腺苷酸（cAMP）水平、提高丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）的磷酸化水平[1]，增加成熟培养基PGE2合成[1-2]，从而在恢复卵母细胞减数分裂和生发泡破裂（GVBD）中起重要作用。ALA 具有一定的抗氧化能力，可以降低牛卵母细胞质中活性氧（ROS）水平[3]，降低人卵母细胞体外成熟培养基脂质过氧化[4]，增加猪卵母细胞质中谷胱甘肽（GSH）水平[5]。ALA 的抗凋亡能力在绵羊[6]、山羊[7]上也有报道。国内关于ALA 对卵母细胞体外成熟影响的研究有少量报道[4,8-9]，但在绵羊上尚未有研究报道。因此，本实验采用ALA 作为绵羊卵母细胞成熟培养基的添加剂，研究ALA 对绵羊卵母细胞体外成熟的影响及其可能的抗氧化作用途径。

1 材料与方法

1.1 材料 促卵泡素（FSH）、促黄体素（LH）、表皮生长因子（EGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、肝素钠、透明质酸酶、无脂肪酸牛血清白蛋白（FA-BSA）购自Solarbio 公司；其余药品均购自美国Sigma 公司。绵羊卵巢采自乌鲁木齐草绿天蓝畜牧公司华凌屠宰场。

1.2 试剂配制 卵巢保存液：0.9%生理盐水+8 mmol/L葡萄糖+0.2 g/L MgCl2+0.2 g/L CaCl2+100 mg/L 青霉素+100 mg/L 链霉素。

采卵液：9.5 g/L TCM199 +5 mmol/L NaHCO3+10 mmol/L HEPES+10 mmol/L HEPES-Na+ 2500 U/L 肝素钠+4 g/L BSA +0.01 g/L 酚红+100 mg/L 青霉素+100 mg/L 链霉素。

卵母细胞基础成熟液：9.5 g/L TCM199+6 g/L BSA+25 mmol/L NaHCO3+500 U/L FSH+500 U/L LH+1 mg/L E2+25 μg/L EGF+5 μg/L VEGF+1.5 mmol/L 葡 萄 糖+5.5 mmol/L乳酸钠+2 mmol/L 丙酮酸钠+1 mmol/L 谷氨酰胺+ 0.1 mmol/L半胱氨酸+100 mg/L 青霉素+100 mg/L 链霉素。

卵母细胞基础成熟液（0 μmol/L）中分别添加10、50、100、200 μmol/L ALA 配置成不同ALA 浓度的卵母细胞成熟液。

0.1%透明质酸酶：1 g/L 透明质酸酶+9.5 g/L TCM199 +2.1 g/LNaHCO3。

1.3 实验方法

1.3.1 离体卵巢收集 绵羊被屠宰后30 min 内将卵巢无菌采集，放置于20～25℃的卵巢保存液中，2～4 h 内带回试验室。为防止卵巢被污染，浸泡卵巢的生理盐水中应加入青霉素、链霉素。

1.3.2 卵母细胞采集 本实验采用抽吸法进行卵母细胞收集。用带有21 G 针头的10 mL 注射器在卵巢上抽吸2～6 mm 卵泡并在抽吸前吸取2 mL 采卵液，从而将卵母细胞吸出流入采卵液。

1.3.3 卵母细胞选择 将采卵液注入培养皿，在体视显微镜下捡出带有卵丘细胞的卵子，通常选择A、B 级卵母细胞进行成熟培养。A 级卵母细胞要求有3 层以上卵丘细胞紧密包围，而且A 级的卵丘细胞扩张充分；B 级要求卵母细胞质均匀，卵丘细胞低于3 层或部分包围卵母细胞。

1.3.4 卵母细胞的成熟培养 培养温度为38.5℃时卵母细胞的成熟率最高，体外培养时间以24 h 为宜。二氧化碳培养箱中培养卵母细胞，气相环境：5%CO2、95%空气、100%湿度。判断卵母细胞是否成熟主要依据卵丘细胞是否扩散并排出第一极体。

1.3.5 观察卵丘细胞扩展情况 采用口吸管将培养卵丘卵母细胞复合体（COCs）后的液滴轻轻吸净，使COCs 整体充分平铺于皿底，以便观察拍照，石蜡油保持不动。卵丘扩展级数的判断引用Vanderhyden[10]的分级方法。并把G3、G4 级扩展定为卵丘扩展状态，G1、G2 级扩展及其他形态（COCs 收缩成团或己经脱落）定为卵丘未扩展状态。

1.3.6 观察第一极体排出情况 IVM 24 h 后将成熟卵母细胞移到0.1%透明质酸酶中，移液枪反复吹打，使卵母细胞成为裸卵，在体视镜下观察卵母细胞第一极体排出情况，记录排出第一极体的卵母细胞数。

1.3.7 抗氧化指标测定 成熟24 h 后收集培养基，利用超氧化物歧化酶（SOD）酶活力检测试剂盒测定SOD总活力；利用谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）酶活力检测试剂盒测定GSH-Px 总活力；利用丙二醛（MDA）检测试剂盒测定MDA 含量。试剂盒购自南京建成生物工程研究所，测定步骤严格按试剂盒说明书进行。通过公式计算被测样品中MDA 含量及 SOD、GSH-Px 活力。

1.4 实验设计

1.4.1 添加不同浓度ALA 对体外成熟绵羊卵丘扩展和卵母细胞核成熟的影响 使用含有不同浓度ALA（0、10、50、100、200 μmol/L）的IVM 培养基孵育绵羊卵母细胞24 h，并观察卵丘扩展情况，统计第一极体排除情况。将COCs 随机分配到5 个组中，分别进行3 次重复。

1.4.2 添加不同浓度ALA 对体外成熟绵羊卵母细胞培养基SOD 和GSH-Px 活力以及MDA 含量的影响 使用含有不同浓度ALA（0、10、50、100、200 μmol/L）的IVM 培养基孵育绵羊卵母细胞24 h，收集培养基并保存在-20℃以供后续测定。将COCs 随机分配到5 个组中，每个指标测定分别进行3 次重复。

1.5 统计分析 数据处理使用SPSS 21.0 统计学软件包。以平均数±标准差或百分率表示不同类型数据。多组比较满足正态性和方差齐性的采用单因素方差分析，不满足则采用K 个独立样本检验或Kruskal-Wallis 秩和检验。检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 添加不同浓度ALA 对绵羊体外成熟卵丘扩展和卵母细胞核成熟的影响 如表1 和图1 所示，添加50、100 μmol/L ALA 卵丘扩展率较对照组增加（P＜0.05），而添加200 μmol/L ALA 具有抑制卵丘扩展的趋势。与对照组相比，100 μmol/L ALA 组观察到核成熟率增加（P＜0.05），添加200 μmol/L ALA 具有抑制细胞核成熟的趋势。添加100 μmol/L ALA 较添加50 μmol/L ALA 更能促进绵羊卵丘扩展和卵母细胞核成熟。由此可知，添加100 μmol/L ALA 可以促进绵羊体外成熟后的卵丘扩展和核成熟。

2.2 添加不同浓度ALA 对绵羊卵母细胞体外成熟培养基SOD 和GSH-Px 活力及MDA 含量的影响 如表2 所示，与对照组相比，添加100 μmol/L ALA 的培养基SOD 活力增加（P＜0.05）；添加100 μmol/L ALA 可以增加培养基GSH-Px 活力（P＞0.05）；添加50、100 μmol/L ALA可降低MDA 含量（P＜0.05）。由此推出，绵羊卵母细胞成熟培养基添加100 μmol/L ALA 可以起到抗氧化作用，改善绵羊卵母细胞发育的微环境，从而能提高卵母细胞的核成熟率。

表1 不同浓度ALA 对绵羊卵丘细胞扩展和卵母细胞核成熟的影响

图1 体外成熟24 h 后绵羊卵丘扩展状态（4×10）及排出第一极体的核成熟卵母细胞（10×10）

表2 不同浓度ALA 对绵羊卵母细胞成熟培养基酶活力和MDA 含量的影响

3 讨 论

Veshkini 等[6]通过气相色谱法测定小卵泡和大卵泡卵泡液中ALA 平均浓度分 别为75.4、125.7 μmol/L。本实验结果表明，在IVM 无血清培养基中添加100 μmol/L ALA 可以促进绵羊卵母细胞的卵丘扩展和核成熟，而200 μmol/L ALA 可能抑制卵丘扩展和核成熟，这种促进作用与成熟培养基抗氧化能力的增强有关。

本实验中，添加100 μmol/L ALA 显著促进绵羊卵母细胞的核成熟。Veshkini 等[6]实验表明，添加100 μmol/L ALA具有促进绵羊卵母细胞核成熟的趋势；Ghaffarilaleh 等[2]在3 月龄羔绵羊上的实验也证明，添加50 μmol/L ALA（羔羊卵泡液ALA 生理浓度范围为22.7～40.8 μmol/L）d并不能显著促进核成熟。但Veshkini 等[6]和Ghaffarilaleh 等[2]的实验均表明，添加200 μmol/L ALA 会显著抑制细胞核成熟。Marei 等[1,3]、郑海英等[8]研究表明，添加50 μmol/L ALA显著促进牛卵母细胞的核成熟，Marei 等[1]还发现添加100、200 μmol/L ALA 可造成牛卵母细胞核成熟率的显著降低以及核成熟显著异常。这与本实验添加100 μmol/L ALA促进绵羊核成熟的实验结果形成了浓度差异，可能是由于ALA 在牛羊卵泡液里生理浓度范围不同导致的，在牛卵泡液中ALA 浓度为35.9～71.8 μmol/L[11]。Marei 等[1]认为，添加100 μmol/L 和200 μmol/L ALA 抑制核成熟的现象可能与抑制卵丘扩展有关，这也与本实验中添加200 μmol/L ALA 抑制绵羊卵丘细胞扩展的趋势相一致。

ROS 是由线粒体形成的氧衍生分子并作为细胞代谢的中间产物。高水平ROS 会诱导氧化应激导致线粒体内膜电位的降低、纺锤体的破坏和细胞质三磷酸腺苷（ATP）水平的降低[12]。线粒体内膜电位的大小决定氧化代谢水平和ATP 产生水平，并且与胚胎发育密切相关[13]。卵母细胞成熟过程中的许多事件依赖于ATP的产生，包括细胞骨架的重排、GVBD 和核成熟[14]。即高水平的ROS 会影响卵母细胞的成熟，ROS 水平降低可改善卵母细胞成熟。ROS 水平受内源抗氧化酶如SOD、GSH-Px、过氧化氢酶（CAT）[15]和外源抗氧化剂的调节。本实验得出，ALA 可以通过促进SOD 酶活力和降低脂质过氧化起到抗氧化作用，这也与孙丽君等[4]在人卵母细胞上的结果相一致。为了验证ALA 在培养基中的抗氧化作用是否可以促进胞质成熟，需要检测细胞质里ROS 水平以及内源抗氧化剂GSH 水平，这也是本研究下一步的补充内容。

4 结 论

绵羊卵母细胞成熟培养基添加100 μmol/L ALA 可以起到抗氧化作用，明显改善绵羊卵母细胞发育的微环境，显著提高绵羊卵母细胞的卵丘扩展和核成熟率。