通过提高胞内辅酶水平促进L-苯甘氨酸的合成

刘巧利， 杨套伟， 周俊平， 徐美娟， 张 显， 饶志明

（江南大学 生物工程学院，江苏 无锡214122）

L-苯甘氨酸是一种手性芳香族非天然氨基酸，是合成多种β-内酰胺类抗生素及抗癌药物紫杉醇的重要前体物质[1-4]，在医药产业中具有广泛的应用价值。目前主要通过化学方法合成[5]，但是化学合成法反应条件剧烈、工艺复杂、副产物较多、产品光学纯度不够，且反应中需用到大量有机试剂和剧毒物质，严重污染环境。通过生物催化法合成L-苯甘氨酸，不仅反应条件温和，绿色环保，而且由于酶的底物特异性和立体选择性，副产物较少，产品可以达到光学纯度，易于分离，可直接用于药物的合成[6]。因此，建立高效的生物催化方法在L-苯甘氨酸的工业生产中具有重要的研究意义。

在之前的研究中，通过在大肠杆菌E.coli BL21（DE3）中共表达来源于蜡样芽孢杆菌的亮氨酸脱氢酶（LeuDH）和来源与博依丁假丝酵母的甲酸脱氢酶（FDH）构建胞内辅酶再生体系，利用重组菌E.coli BL21/pETDuet-ldh-fdh作为催化剂，实现了从苯乙酮酸到L-苯甘氨酸的全细胞转化合成[7]。在类似的全细胞转化体系中，添加胞外辅酶（NAD+）可以有效地提高转化速率[8-9]，说明在脱氢酶过表达的情况下，胞内环境存在辅酶供应不足的问题，因此提高胞内辅酶（NAD（H））水平是进一步提高反应速率的有效策略之一。

大肠杆菌中NAD（H）合成途径分为从头合成途径和补救合成途径，见图1。其中烟酸转磷酸核糖基酶（NAPRTase）是补救合成途径的限速酶[10]。通过加强表达NAD（H）合成途径中的关键酶和培养基中添加合成前体物质可有效提高胞内NAD（H）的含量[11]。Berrios-Rivera等[12]在大肠杆菌中表达鼠伤寒沙门氏菌 Salmonella typhimurium来源的NAPRTase基因 （pncB）使胞内NAD+、NADH和总NAD（H）分别提高了 81.8%、29.8%和 41.7%，证明NAPRTase的过表达可有效促进胞内NAD（H）的合成。Witholts等[13]在大肠中过表达自身来源的NAPRTase时，胞内NAD（H）总量提高了5倍。Heuser F等[14]在E.coli中分别过表达 NAPRTase和NAD+合酶时（NAD+Syn），胞内 NAD（H）的总量分别提高了两倍，当同时过表达这两个关键酶基因pncB和nadE时，菌株胞内NAD（H）总量提高了7倍，有效提高了全细胞催化合成（R）-甲基-3-羟基丁胺的反应速率，说明和NAPRTase一样，NAD+Syn也是NAD（H）补救合成途径的限速酶。张鑫等[15]通过在E.coli中过表达pncB和nadE，使全细胞转化合成1，4-丁二醇的转化率提高了13.03%，产物得率提高了40.9%。另外，穆晓清等[16]通过在大肠杆菌中共表达pncB和nadE，在培养基中添加前体物质烟酸（NA）有效地促进了胞内NAD+的合成。

图1 大肠杆菌中辅酶NAD+的从头合成途径及和补救合成途径Fig.1 De novo synthesis pathway and salvage synthesis pathway of coenzyme NAD+in E.coli

基于以上的研究，作者拟在实验室前期构建保藏的L-苯甘氨酸催化合成菌株E.coli BL21/pETDuet-ldh-fdh中共表达NAPRTase和NAD+Syn的编码基因pncB和nadE，并在发酵培养基中添加NA，以期提高重组大肠杆菌胞内NAD（H）的质量摩尔浓度，进而提高全细胞转化苯乙酮酸合成L-苯甘酸的转化效率。

1 材料与方法

1.1 菌株与质粒

本研究所用菌株与质粒见表1。

表1 本研究所用的菌株、质粒和引物Table 1 Strains，plasmids and primers used in this work

1.2 主要试剂与仪器

DL-苯甘氨酸标准品 （纯度＞98.5%，D型和L型的比例为1∶1）、苯乙酮酸标准品（纯度＞98.5%）以及NAD+、NADH：均购自Sigma Aldrich公司；分子生物学工具酶、DNA Markers：均购自TaKaRa公司；基因组提取试剂盒、DNA回收试剂及质粒提取试剂盒：均购自上海捷瑞生物工程有限公司；辅酶I NAD（H）含量测定试剂盒：购自索莱宝公司；引物合成与核酸序列测定：由上海金唯智生物工程公司完成；其他试剂均购自国药集团。PCR仪：购自 Bio-Rad公司；UVP凝胶成像仪：购自英国UVP有限公司；高速冷冻离心机：购自 HITACHI公司；超声破碎仪：购自SONICS公司；高效液相色谱仪：购自Agilent公司；色谱柱：C18、C8及有机酸柱均购自DIMARK公司。

1.3 重组质粒的构建

根据NCBI中公布的E.coli BL21（DE3）来源的NAPRTase基因 pncB（GenBank 登录号：8113566）和NAD+Syn基因 nadE（GenBank 登录号：8179982）序列设计引物，以E.coli BL21（DE3）基因组为模板，进行PCR扩增，PCR产物pncB和nadE经过试剂盒纯化后，分别连接至克隆载体pMD18-T，转化E.coli JM109，通过氨苄青霉素（Amp）平板筛选阳性转化子，提质粒酶切验证，并进行测序鉴定。目的基因分别与表达载体pACYCDuet-1连接，构建重组质粒pACYCDuet-pncB和 pACYCDuet-nadE，转化 E.coli BL21（DE3）得到重组菌E.coli BL21/pACYCDuetpncB和E.coli BL21/pACYCDuet-nadE，通过氯霉素（Cm）平板筛选阳性转化子。两基因依次连接载体可得重组质粒pACYCDuet-pncB-nadE，转化重组菌E.coli BL21/pETDuet-leudh-fdh，通过Amp/Cm双抗平板筛选阳性转化子，验证正确即得到双质粒共表达重组菌 E.coliBL21/pETDuet-ldhfdh&pACYCDuet-pncB-nadE。

1.4 重组菌的培养及诱导

LB种子培养基：蛋白胨 10 g/L，酵母粉 5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0。

发酵培养基：蛋白胨 12 g/L，酵母粉 24 g/L，甘油 5 g/L，KH2PO42.31 g/L，K2HPO412.54 g/L。

各重组菌按照1%的接种体积分数转接入10 mL含相应抗性的种子培养基，37℃、180 r/min下培养10 h。种子液再按照1%的接种体积分数接入发酵培养基，37℃下培养，至菌体OD600为0.3～0.5，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度为 0.5 mmol/L，24 ℃、160 r/min诱导 12 h。

发酵培养基中NA的添加：NA用蒸馏水配成5 g/L的添加液，通过过滤除菌，并低温冷冻保藏，在IPTG诱导培养时加入发酵培养基。

1.5 酶活测定

4℃下离心发酵菌液（8 000 r/min离心5 min），并用0.1 mol/L的磷酸缓冲液（pH 7.0）洗涤细胞两次后，按照10倍浓缩的比例用缓冲液重新悬浮菌体，低温下对菌体进行超声破碎，12 000 r/min离心20 min，得到破碎上清粗酶液，用于SDS-PAGE分析及酶活测定。LeuDH和FDH酶活测定分别参考Ansorge[17]和 Zheng 等[18]的报道，NAPRTase 和 NAD+Syn的酶活测定参考Heuser F等[14]的报道。蛋白质质量浓度检测采用Bradford法[19]，以牛血清蛋白BSA为标准品。

1.6 胞内NAD（H）质量摩尔浓度测定

发酵培养基培养各E.coli菌株至对数中后期，取培养液用于测定胞内NAD+和NADH质量摩尔浓度。分别用酸性和碱性提取液提取样品中NAD+和NADH，NADH通过PMS的递氢作用，还原氧化型噻唑蓝（MTT）为甲瓒，在570 nm下检测吸光值；而NAD+可被乙醇脱氢酶还原为NADH，进一步采用MTT还原法检测。

具体操作步骤参考试剂盒说明书及相关参考文献[20-21]。

1.7 细胞浓度及全细胞催化活性的测定

取1 mL菌液用蒸馏水适当稀释，用紫外分光光度计测稀释菌液600 nm下的吸光度 （OD600），细胞干重（DCW）可通过以下公式计算[22]：

DCW（g/L）=0.444 2×OD600-0.021

在全细胞转化中，细胞催化活性定义为反应初始时每克干细胞每分钟催化合成L-苯甘氨酸的量。在全细胞转化反应持续30 min时取样，4℃、10 000 r/min下离心5 min以终止反应，上清液经稀释通过HPLC检测L-苯甘氨酸的产量，用于计算细胞催化活性。

1.8 全细胞法催化合成L-苯苷氨酸

底物苯乙酮酸30 g/L溶于0.1 mol/L pH 7.5的磷酸缓冲液，滴加50%的NH3·H2O使其溶解，同时加入2.4 g甲酸铵及体积分数5%的甘油，最后加入全细胞催化剂 5 g/L（DCW），转化体系为20 mL，置于磁力搅拌器上进行转化，控制温度为30℃，pH 8.0，转速160 r/min，反应过程中通过滴加50%的NH3·H2O或20%的甲酸来调节反应体系的 pH。L-苯甘氨酸的产量及ee值通过HPLC检测，具体方法参考Cheng等[23]的检测方法。

2 结果与讨论

2.1 NAPRTase和NAD合酶基因的克隆及共表达

以大肠杆菌E.coli BL21（DE3）基因组为模板，分别利用引物对P1/P2和P3/P4进行PCR扩增，PCR产物分别为1 203 bp和828 bp，经测序鉴定与NCBI数据库报道pncB和nadE序列一致，通过限制性酶切法将目的基因与表达载体pACYCDuet-1连接，构建重组表达载体，酶切及PCR验证结果见图2，证明NAPRTase和NAD+Syn的重组共表达载体pACYCDuet-pncB-nadE构建成功。将经过诱导培养的各重组菌及原始菌分别超声破碎并离心后，取上清液进行SDS-PAGE分析及酶活测定。SDSPAGE分析结果见图3。

图2 重组载体pACYCDuet-pncB-nadE酶切及PCR验证Fig.2 Restriction and PCR validation of recombinant vector pACYCDuet-pncB-nadE

图3 各重组菌的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of the recombinant strains

在单表达及单质粒共表达时NAPRTase和NAD+Syn分别在44 100和30 400处有明显的表达条带，在双质粒共表达时，LeuDH、FDH和NAPRTase的相对分子质量差异较小，均位于为40 000附近，因此在共表达SDS-PAGE分析时三者无法区分，NAD+Syn有明显的表达条带，说明通过该双质粒表达系统成功实现了 LeuDH、FDH、NAPRTase和NAD+Syn在E.coli中的共表达。分别测各重组菌粗酶液酶活，以原始菌表达空载pETDuet-1作为对照，结果见表2。重组菌E.coli BL21/pETDuet-ldh-fdh LeuDH酶活为18.78 U/mg，是对照的300多倍，FDH酶活为0.34 U/mg，对照组未检测到FDH酶活；重组菌 E.coli BL21/pACYCDuet-pncB NAPRTase酶活为 2.12 U/mg，是对照的14倍，重组菌 E.coli BL21/pACYCDuetnadE NAD+Syn酶活为1.24 U/mg，是对照的41倍，说明 NAPRTase和NAD+Syn在 E.coli BL21（DE3）中成功过表达。对重组菌E.coli BL21/pETDuetldh-fdh&pACYCDuet-pncB-nadE的酶活分析发现，LeuDH和FDH的酶活与单质粒菌株E.coli BL21/pETDuet-ldh-fdh的酶活差异不明显，而NAPRTase及NAD+Syn的酶活却明显低于重组菌E.coli BL21/pACYCDuet-nadE，但高于对照组，酶活结果与蛋白质表达情况一致，说明该双质粒表达体系中各酶均可以有效表达，且重组质粒pACYCDuet-pncB-nadE的表达对参与转化的LeuDH和FDH的表达影响不大，可能的原因是pET质粒的ColE1复制子强度大于pACYC质粒的p15A复制子[24]。

表2 不同菌株的酶活Table 2 Enzyme activities in different strains

2.2 NAPRTase和NAD合酶的表达对菌体生长及胞内辅酶的影响

各重组菌株经37℃活化后，于24℃下诱导培养12 h，首先通过紫外分光光度计测其细胞浓度（OD600），并计算细胞干重，之后收集菌体检测胞内NAD（H）质量摩尔浓度，结果见表3。基因pncB和nadE在大肠杆菌中的过表达分别使提高胞内NAD（H）质量摩尔浓度提高了86.3%和59.3%，当两者共表达时则提高了2.92倍，双质粒重组菌E.coli BL21/pETDuet-ldh-fdh&pACYCDuet-pncB-nadE胞内NAD（H）质量摩尔浓度较重组菌E.coli BL21/pETDuet-ldh-fdh提高了2.35倍，但是NADH/NAD+的值在各重组菌中波动不大，说明pncB和nadE的过量表达均可促进胞内NAD+的合成，使得胞内NAD（H）质量摩尔浓度显著提高，并不会造成胞内氧化还原态失衡，且两者对NAD+合成的促进作用具有累加效应。另外，pncB和nadE过表达的重组菌生物量均不同程度地高于对照菌株，说明胞内NAD（H）质量摩尔浓度的提高对细胞生长具有一定的促进作用，可能是因为胞内NADH质量摩尔浓度的提高增加了细胞生长的能量供给。

2.3 烟酸质量浓度对菌体生长及胞内辅酶的影响

为了进一步提高胞内辅酶水平，在发酵培养基中添加不同质量摩尔浓度的NAD+补救合成途径前体物质NA，分别测定重组菌E.coli BL21/pETDuetldh-fdh&pACYCDuet-pncB-nadE细胞浓度与胞内NAD+质量摩尔浓度，结果见图4。当NA质量浓度≤20 mg/L时，胞内NAD+质量摩尔浓度随NA质量浓度的增加而提高，当NA质量浓度为20 mg/L，胞内NAD+质量摩尔浓度最高为25.2 μmol/g DCW，比不添加NA时提高了2.42倍，当NA质量浓度继续增加时，NAD+质量摩尔浓度则逐渐下降，说明过量的NA不利于NAD+的合成。同时考察了NA质量浓度对菌体生长的影响，当NA质量浓度＜20 mg/L时，菌体量随NA质量浓度的增加而增加，可能与胞内NAD+质量摩尔浓度的增加相关，但是当NA质量浓度进一步增加时，菌体生长明显受到抑制，说明过量的NA不利于菌体的生长和胞内辅酶水平的提高，因此发酵培养基中NA的最佳添加质量浓度为20 mg/L。同时发现NA的添加对重组菌E.coli BL21/pETDuet-ldh-fdh胞内NAD+质量摩尔浓度没有显著的提高作用，说明胞内辅酶水平的提高是胞外NA的添加和胞内pncB、nadE过表达共同作用的结果。

表 3 各重组菌的生长情况及胞内NAD（H）含量测定Table 3 Growth and intracellular NAD（H）concentration of different recombinant strains

图4 烟酸质量浓度对菌体生长及胞内NAD+摩尔浓度的影响Fig 4 EffectofNA concentration on growth and intracellular NAD+concentration

2.4 胞内辅酶水平对全细胞转化的影响

将重组菌E.coli BL21/pETDuet-ldh-fdh和E.coli BL21/pETDuet-ldh-fdh&pACYCDuet-pncB-nadE分别活化，并分别转接于添加20 mg/L的NA和不添加NA的发酵培养基中进行诱导，4℃离心，收集菌体用于L-苯甘氨酸的转化合成，分别检测不同菌株于不同培养基条件下的细胞催化活性，结果见图5（a）。在发酵培养基中未添加NA时，重组菌E.coli BL21/pETDuet-ldh-fdh&pACYCDuet-pncB-nadE的细胞催化活性比菌株E.coli BL21/pETDuetldh-fdh提高了56.5%，而当发酵培养中添加20 mg/L NA时，前者的细胞催化活性进一步提高了34.2%，而后者则提高不明显，这与pncB和nadE的过表达及发酵培养基中NA的添加对胞内辅酶水平的调节作用一致，说明胞内pncB和nadE的过表达及胞外NA的添加共同通过提高胞内辅酶水平来提高细胞催化活性。分别以不添加NA诱导的菌株E.coli BL21/pETDuet-ldh-fdh和添加NA诱导的菌株E.coli BL21/pETDuet-ldh-fdh&pACYCDuet-pncB-nadE为全细胞催化剂，在底物质量浓度为30 g/L，细胞质量浓度为5 g/L（DCW）的条件下，进行L-苯甘氨酸的转化反应，结果见图5（b）。与单质粒表达菌株相比，双质粒菌株全细胞转化苯乙酮酸的转化率提高了36.6%，L-苯甘氨酸的产量从16.7 g/L提高至23.9 g/L，说明胞内辅酶水平的提高可以显著提高全细胞催化活性，最终提高全细胞转化效率和L-苯甘氨酸的产量。

3 结 语

图5 胞内辅酶水平提高对全细胞转化的影响Fig.5 Effect of intracellular cofactor level on the whole cell biotransformation

在重组大肠杆菌中过表达NAPRTase和NAD+Syn的编码基因pncB和nadE，不仅可以有效地促进胞内NAD+的合成，提高胞内辅酶水平，并对菌体生长具有一定的促进作用，且两者对NAD+合成的促进作用具有累加效应。发酵培养基中添加20 mg/L的NAD+补救合成途径前体物质NA使得胞内辅酶水平进一步提高，最终将重组菌E.coli BL21/pETDuet-ldh-fdh&pACYCDuet-pncB-nadE用于全细胞转化合成L-苯苷氨酸，其细胞催化活性和转化率分别比重组菌E.coli BL21/pETDuet-ldh-fdh提高了94%和36.6%，说明在辅酶依赖型的全细胞转化体系中，胞内辅酶水平的提高可以有效地提高转化效率。