花生中油酸与亚油酸含量测定方法研究

2019-05-23 08:41张嘉楠宋亚辉陈四龙李玉荣
石家庄学院学报 2019年3期
关键词:亚油酸油酸甲酯

赵 星 ,张嘉楠 ,杨 华 ,王 瑾 ,宋亚辉 ,陈四龙 ,李玉荣

(1.河北省农林科学院粮油作物研究所 河北省作物遗传育种实验室,河北 石家庄 050035;2.石家庄学院 化工学院,河北 石家庄 050035;3.河北省农林科学院谷子研究所 国家谷子改良中心,河北 石家庄 050035)

0 引言

花生又名落花生、长生果,是全球最重要的四大油料作物之一,在世界油脂生产中具有举足轻重的地位.中国是世界最大的花生生产国,除西藏、青海外,其他省份均有种植,并以山东、河南、河北、广东、安徽等地的产量和种植面积最大.花生富含维生素、矿物质和多种生物活性物质,并含有多种对心脏有益的物质,例如不饱和脂肪酸、钾、镁、烟酸、甾醇、白藜芦醇、类黄酮等[1-3].长期以来,我国60%的花生用于榨油[4],花生油气味醇香,深受人们喜爱,被誉为“中国的橄榄油”.脂肪酸的组成是决定花生油质量的重要因素,花生中的脂肪酸包括饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸,不饱和脂肪酸的含量达85%以上,且以对心血管疾病有益的油酸与亚油酸为主[2,3,5].油酸具有降低高血脂症患者血脂水平以及预防心血管疾病的作用,而油酸/亚油酸(O/L)影响着油脂的氧化稳定性,即货架期,是决定花生油品质的重要因素[6].因此,对花生中的油酸与亚油酸进行定量分析,是进行花生原料品质评价的重要步骤.

本研究以花生仁为原料,采用超声波辅助提取法获得的正己烷提取液为样品溶液,以十七烷酸甲酯为内标,确定最佳气相条件,并进行方法学验证,为花生中油酸与亚油酸的含量测定建立专属性强、准确度高、重复性好、操作简便的气相分析方法.

1 材料与方法

1.1 实验仪器与材料

安捷伦6890N型气相色谱仪(配有FID检测器与气相色谱工作站,美国安捷伦公司);SB-5200D型数控超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司);AL204型电子天平购自梅特勒-托利多仪器有限公司;HHS-21.6型水浴锅购自山西省文水医疗器械厂;PICO21型离心机购自赛默飞世尔科技公司;Research型移液器购自德国Eppendorf公司.

正己烷(色谱纯,德国默克公司);甲醇(色谱纯,美国Fisher公司);十七烷酸甲酯、油酸甲酯、亚油酸甲酯对照品均购自美国Sigma-Alorich公司;氢氧化钾为国产分析纯;去离子水由美国Milli-Q Academic纯水器制备.花生仁样品由河北省农林科学院粮油作物研究所花生组自采,采制日期为2013年10月.

1.2 溶液的制备

1.2.1 内标溶液的制备

取十七烷酸甲酯适量,精密称定,置50 mL的量瓶中,以甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀后得浓度为0.298 6 mg/mL的内标溶液,置4℃冰箱中保存,备用.

1.2.2 标准储备液的制备

取油酸甲酯与亚油酸甲酯适量,精密称定,分别置5 mL的量瓶中,以甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,得浓度分别为58.60 mg/mL和54.85 mg/mL的标准储备液,置4℃冰箱中保存,备用.

1.2.3 系列标准溶液的制备

精密量取油酸甲酯与亚油酸甲酯的标准储备液适量,置同一5 mL量瓶中,以甲醇稀释至刻度,摇匀,得浓度分别为10.15 mg/mL和7.032 mg/mL的混合标准储备液;取混合标准储备液,以甲醇逐级稀释制成油酸甲酯(亚油酸甲酯)浓度分别为 10.15(7.032),5.074(3.516),2.029(1.406),1.015(0.703 2),0.5074(0.351 6),0.2029(0.140 6),0.101 5(0.070 32)mg/mL 的系列标准溶液,临用现配.

1.2.4 甲酯化试剂的制备

取氢氧化钾适量,加入少量水溶解,以甲醇稀释,配制成浓度为0.4 mol/L的KOH-甲醇溶液,室温放置24 h,即得.

1.3 油酸与亚油酸样品提取液的制备

取粉碎并烘干至恒重的花生仁样品0.1 g,精密称定,置于10 mL量瓶中,加入正己烷1 mL,浸泡30 min后,于45℃下超声(功率250 W)提取20 min,冷却至室温,以正己烷稀释至刻度,摇匀,离心15 min(室温,14 000 r/min)后,上清液以正己烷稀释5倍,即得.

1.4 油酸甲酯与亚油酸甲酯供试溶液的制备

精密量取上述样品提取液250 μL、甲醇100 μL、内标溶液100 μL于2 mL离心管中,加入甲酯化试剂0.5 mL,混匀,于60℃水浴反应20 min,期间振荡混匀3次.反应结束后,冷却至室温,加入0.6 mL去离子水,摇匀,离心15 min(室温,14 000 r/min),分离正己烷层于200 μL离心管中,进行气相色谱分析.

1.5 气相色谱分析

色谱柱:Agilent DB-23 毛细管柱(0.25 μm×320 μm×30 m);载气:氮气;升温程序:初始温度 140℃,以8℃/min升至220℃,保持3 min,然后以10℃/min上升到220℃,保持5 min;进样口及检测器温度:250℃;柱流量:0.7 mL/min;分流比:1∶20;进样量:2 μL.

1.6 数据处理

采用安捷伦6890N工作站计算内标、油酸甲酯、亚油酸甲酯色谱峰的保留时间(tR)、峰面积(A)、对称因子(T)、分离度(R)与理论塔板数(N),并将内标、油酸甲酯、亚油酸甲酯色谱峰面积分别代入公式(1)、(2),计算花生样品中油酸与亚油酸的含量.

式中(A油/A内)样,(A亚油/A内)样分别代表供试溶液中油酸甲酯、亚油酸甲酯与内标色谱峰面积的比值;(A油/A内)对,(A亚油/A内)对分别代表对照品中油酸甲酯、亚油酸甲酯与内标色谱峰面积的比值;c油,c亚油分别代表对照品溶液中油酸甲酯、亚油酸甲酯的浓度(单位:mg/mL);V样为样品提取时所用量瓶的体积(单位:mL);F油,F亚油分别代表油酸、亚油酸的校正系数,F油=1.905 4,F亚油=1.904 8;W样为样品提取时的称样量(单位:g).

2 结果与讨论

2.1 系统适用性

精密吸取内标溶液、对照溶液和无内标的供试溶液各2 μL进样,记录色谱图(图1),内标物、油酸甲酯、亚油酸甲酯的保留时间分别为8.29,9.38,9.84 min,对称因子、各峰与相邻峰的分离度均符合气相色谱的定量要求[7],理论板数按油酸甲酯峰计算不低于5 000,且内标物与样品中的各成分无交叉干扰.

精密吸取供试溶液2 μL,重复进样6次,记录色谱图,分别计算油酸甲酯、亚油酸甲酯与内标物峰的相对峰面积(A油/A内)、(A亚油/A内)的相对标准偏差(RSD)分别为1.43%和0.51%,色谱系统重复性符合定量要求[7].

2.2 线性与范围

精密量取系列标准溶液各100 μL,分别置于2 mL离心管中,以250 μL正己烷代替样品提取液,加入内标溶液100 μL,按1.4节的方法处理,照1.5节的色谱条件进样分析,记录色谱图.每个浓度3样本分析,分别以油酸甲酯与亚油酸甲酯质量浓度(mg/mL)为横坐标(X),平均相对峰面积为纵坐标(Y),采用加权最小二乘法进行线性回归,权重系数以1/X2计算,所得的回归方程即为标准曲线.

按照上述方法计算,油酸甲酯、亚油酸甲酯的回归方程与相关系数(r)分别为:油酸甲酯:Y=4.210X-0.027,r=0.999 3(n=7);亚油酸甲酯:Y=3.906X-0.042,r=0.999 3(n=7).

结果表明,油酸甲酯、亚油酸甲酯分别在质量浓度0.101 5~10.15 mg/mL和0.070 32~7.032 mg/mL范围内呈良好的线性关系,在样品定量分析过程中,可采用“一点法”进行浓度计算,经推导得公式(1)和(2).油酸甲酯、亚油酸甲酯混合标准溶液的推荐浓度分别为1 mg/mL与0.7 mg/mL.

图1 内标溶液、对照溶液和无内标物的供试溶液色谱图

2.3 重复性

2.3.1 衍生化反应重复性

取来源相同的样品提取液,按照1.4节的方法处理进行衍生化处理,平行6样本,进行气相色谱分析,记录峰面积,分别计算油酸甲酯与亚油酸甲酯相对峰面积的RSD,考察油酸与亚油酸衍生化反应的重复性.结果表明,油酸甲酯与亚油酸甲酯相对峰面积的RSD分别为4.33%和4.04%,衍生化反应重复性良好,可满足油酸与亚油酸的定量测定要求.

2.3.2 方法重复性

取来源相同的花生样品,按1.3节和1.4节的方法处理,平行6样本,进行气相色谱分析,记录峰面积,分别代入公式(1)、(2)计算油酸、亚油酸的含量及其RSD,考察方法的重复性.结果表明,花生样品中油酸与亚油酸6次测定结果的平均值分别为179.5 mg/g和150.6 mg/g,RSD分别为2.43%和2.11%,方法重复性良好.

2.4 回收率

取与2.3.2节来源相同的花生样品0.05 g,精密称定,置10 mL量瓶中,精密加入含油酸(亚油酸)17.98(15.06)mg/mL的溶液0.5 mL,按照1.3和1.4节的方法处理,平行6样本,进行气相色谱分析,记录峰面积,并按照公式(3)计算回收率:

结果表明,油酸、亚油酸的平均回收率分别为95.59%和97.42%,RSD分别为1.97%和2.11%,方法准确度高,能够满足花生中油酸、亚油酸定量分析的要求.

2.5 稳定性

2.5.1 油酸与亚油酸样品提取液的稳定性

取来源相同的花生样品3份,照1.3节的方法制备样品提取液,分别在室温下放置0,1,2,3,5 h后,按照1.4节方法处理,进行气相色谱分析,记录峰面积,分别计算各时间点相对峰面积与0 h相对峰面积的相对误差(RE),考察油酸与亚油酸样品提取液的稳定性.结果表明,室温下放置2 h以内,油酸、亚油酸的RE分别为-2.24~4.59%和-2.98~4.74%,放置3 h之后,个别样品中油酸、亚油酸的RE>5.0%.由此可见,油酸与亚油酸样品提取液的稳定性较差,应临用现配,制备完成后应尽快进行衍生化,不宜长时间放置.

2.5.2 油酸与亚油酸甲酯供试溶液的稳定性

取新制备的3份衍生化溶液,分别在室温放置0,1,3,7,24,48 h后进样,记录峰面积,分别计算各时间点与0 h相对峰面积的RE,考察油酸甲酯与亚油酸甲酯供试溶液的稳定性.结果表明,室温下放置48 h,油酸甲酯、亚油酸甲酯的RE分别为-1.24~3.80%和-0.76~2.34%.由此可见,供试溶液于制备后48 h内稳定,在气相分析过程中,因放置时间与进样顺序不同而引入的误差可忽略不计.

2.6 讨论

2.6.1 衍生化方法的选择

本研究比较了三氟化硼法[8]与氢氧化钾-甲醇法对油酸与亚油酸甲酯化的衍生效果,发现三氟化硼的加入会使花生中油酸、亚油酸样品提取液在甲酯化过程中产生白色沉淀,且气相色谱图中油酸甲酯与亚油酸甲酯色谱峰响应降低,出现比采用氢氧化钾-甲醇法进行甲酯化更多的“本底峰”.因此,本研究采用操作简便、“本底峰”较少、毒性相对较低的氢氧化钾-甲醇法进行衍生化.考察了反应温度与时间对油酸与亚油酸甲酯化效率的影响,为了缩短反应时间,排除环境温度变化的影响,并且兼顾油酸与亚油酸样品提取液的稳定性,最终确定于60℃下反应20 min.

2.6.2 校正因子的应用

本研究以油酸甲酯与亚油酸甲酯为对照品,通过加校正因子对花生中的油酸、亚油酸的含量进行计算.因为在回收率的考察中,油酸、亚油酸对照品在实验过程中未表现出与花生样品所含油酸、亚油酸相同的甲酯化效率,且花生样品提取液甲酯化得到的油酸甲酯、亚油酸甲酯色谱峰在保留时间、对称因子、理论板数等方面,均与油酸甲酯、亚油酸甲酯对照品无统计学差异.推测产生这一现象的原因,可能是由于本研究测定总油酸与总亚油酸,而花生中的油酸、亚油酸存在多种顺、反异构体[9],不同异构体在甲酯化效率上可能存在着差异.

2.6.3 定量方法的选择

在精密度验证中发现,直接以油酸与亚油酸甲酯峰面积计算含量时,RSD分别为6.47%和5.90%,不符合定量分析的要求,故本研究采用内标法,可有效控制甲酯衍生化过程和气相色谱分析进样误差,获得了满足定量分析要求的准确度和精密度.在稳定性试验过程中,发现由于正己烷的挥发性强,供试溶液放置48 h后可能出现溶液被浓缩或挥干现象,以正己烷稀释或复溶处理后,采用内标法计算,不影响油酸甲酯与亚油酸甲酯的定量结果.虽有文献[10]报道,花生中含有十七烷酸,然而在所选样品浓度范围内,花生中十七烷酸甲酯化后产生的色谱信号低于仪器的检测限(信噪比S/N<3),在所选条件下,不产生色谱峰,对油酸、亚油酸定量分析的干扰可忽略不计.

3 结论

本研究以正己烷为提取溶剂,采用超声波辅助提取法制备样品提取液,氢氧化钾-甲醇法进行甲酯衍生化制备供试溶液,并以十七烷酸甲酯为内标,建立了花生中油酸与亚油酸含量测定的气相色谱方法.经方法学验证,本研究所建立的定量分析方法专属性强、灵敏度高、准确可靠、重现性好,且操作简便、耗时短、毒性小、检测费用低,适用于花生中油酸与亚油酸的常规定量分析,为花生原料品质的评价与质量的控制研究奠定了基础.

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