布鲁氏菌病快速检测试纸条的探索

孔玉方，郑家昊2，王慧煜，梅 琳，吴绍强，林祥梅，韩雪清

布鲁氏菌病(Brucellosis)(简称布病)是由布鲁氏杆菌引起的以流产和发热为特征的人兽共患病，严重威胁人和多种动物的生命健康[1]。该病不仅对动物的繁殖和生产性能具有严重危害，而且人在感染布鲁氏菌后，难以治愈，从而造成严重的公共卫生问题。目前，全球有170多个国家和地区发现有人、畜布病的流行和分布[2]。此外，野生动物也会携带布鲁氏菌，进而引发家畜患病，这也是老病新发的原因。因此对布病的防控成为当前我国和全球关注的重大公共卫生健康问题。

目前，病原学检测是诊断布病的金标准，而布鲁氏菌的分离培养对实验室和实验人员的要求较高，需要具有经验丰富的专业人员在BSL-3(Biosafety Level 3 Laboratory)级以上的实验室操作[3]。虎红平板凝集实验(rose-bengal plate agglutination test，RBT)和试管凝集实验(standard tube agglutination test ，SAT)具有敏感性高和特异性强的检测特点，可用于布病的早期诊断，但不适用于现场样品的快速筛查[4]。而基于布鲁氏菌全菌作为抗原的 ELISA需在实验室内进行，不适用于现场快速检测[5]。因此，建立一种适用于现场快速检测的方法对布病防控具有重大意义。有相关实验研究发现布鲁氏菌外膜蛋白(Outer membrane proteins，OMPs)是继LPS后又一布病优势诊断抗原[6-7]。OMP28蛋白又称BP26或CP28，是一种由细胞内向细胞外释放的可溶性外周浆蛋白。1996年，Lindler等[6]研究结果表明OMP28蛋白均可检测到羊、牛、鼠感染的布鲁氏菌，该蛋白具有较强的免疫原性和免疫反应性，可作为布鲁氏菌的诊断抗原。2008年，宫晓炜等[8]发现BP26在人注射的疫苗中没有缺失和弱化，采用免疫印迹检测BP26蛋白，发现该蛋白敏感性高、特异性强。Kaushik P等[9]发现在OMP28诱导下体内IgG含量猛增，还可以诱导以IgG2a介导的免疫反应。OMP22蛋白是由213个氨基酸组成，属于OMP25/OMP31家族蛋白，在布鲁氏杆菌的各个种属间保守性高，这与布病的感染力有关[10]。OMP22蛋白的免疫反应能力与布鲁氏菌的脂多糖相似，均能诱导机体产生免疫反应[11-12]。OMP22蛋白作为布病的重要毒力因子，在致病过程中OMP22蛋白主要表达分泌于细菌的表面，会引起较高的Th1免疫反应[13]。此外，外膜蛋白OMP22可以在大肠杆菌中大量表达，降低了该蛋白作为诊断抗原的成本。

目前免疫层析技术具有快速、准确、结果肉眼可视和无需辅助仪器检测等特点，特别适合现场样品快速初筛和基础推广。本研究将重组的布鲁氏菌外膜蛋白OMP22和OMP28的混合蛋白作为胶体金标记物，抗OMP22单克隆抗体作为质控线(C线)OMP22和OMP28混合蛋白作为检测线(T线)，组装成检测布鲁氏菌病的免疫层析试纸条，为现场初筛提供了新的技术支持。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1蛋白与血清 布鲁氏菌重组蛋白OMP22、OMP28和抗OMP22单克隆抗体由中国检验检疫科学研究院动检所制备；布鲁菌标准阴性、阳性血清均购自中国兽医药品监察所；牛源结核病血清、蓝舌病血清、牛病毒性腹泻血清、口蹄疫血清、牛白血病血清、小反刍兽疫血清及牛、羊、马、猪源血清样品，中国检验检疫科学研究院动检所保存。

1.1.2主要试剂 氯金酸(HAuCl4·4H2O)、柠檬酸三钠、高效清洗剂(Formula)、胶体金涂镀剂(F-1307)、吸水纸(Paper-2030)、NC膜(Millipore HiFlow-95)、白色底板和金标垫(Gls-17930)北京吉森生物科技有限公司，其他试剂均为国产分析纯。

1.1.3主要仪器 三位喷点系统(XYZ3050TM)，和切纸机系统(CM4000TM)美国BIO DOT公司；电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9030A型)上海中友仪器设备有限公司；台式冷冻超高速离心机BECKMAN COULTER；超纯水系统美国 Milipore公司。

1.2 方 法

1.2.1胶体金制备 柠檬酸三钠还原法制备40 nm胶体金溶液：取0.01%氯金酸溶液100 mL加热至沸腾后加入1%柠檬酸三钠水溶液1 mL，2 min内金黄色氯金酸溶液变为紫色，继续加热沸腾10 min，冷却后添加蒸馏水恢复至原体积，该方法制备的胶体金溶液采用紫外分光光度计扫描(UV-Vis)，可见光区最高吸收峰在(525±2)nm处为合格。

1.2.2蛋白标记浓度的确定 采用目测法确定胶体金与待标蛋白质用量比例，取8个1.5 mL离心管分别加入1 mL的胶体金溶液，用0.2 mol/L K2CO3调pH 8.2，再加入用0.005 mol/L，pH值9.0的硼酸盐缓冲液稀释的3～15 μg /mL的OMP22和OPM28混合蛋白，5 min后在上述各管中加入0.1 mL 10% NaCl溶液，混匀后静置2 h后肉眼观察，保持红色最低浓度即为蛋白最佳包被浓度，按照表1操作。

表1 蛋白最佳标记浓度Tab.1 Optimal amount of protein

编号胶体金/mLK2CO3/μL蛋白/μgPB/μL10%NaCl/μL111001001002110397100311059510041107931005110991100611011891007110138710081101585100

1.2.3胶体金标记过程 取5 mL胶体金溶液至15 mL离心管内平衡至室温，用0.1 mol/L K2CO3调pH8.2，然后根据1.2.2获取的最适蛋白包被浓度加入相应量的OMP22和OMP28，搅拌器搅拌20 min混匀，接着加入10% BSA 0.25 mL搅拌10 min，最后加入20%P EG20000 0.012 5 mL搅拌10 min， 10 000 r/min 4 ℃离心15 min，弃上清保留浓缩胶体金颗粒，加入1/10体积含1%BSA的PB液保存备用。

1.2.4胶体金试纸条制备

1.2.4.1金标垫预处理 将金标垫浸泡入含有表面活性剂和金释放液20 g/L BSA 、1 mL TrionX-100和25 g/L的PBS(pH7.4)缓冲液中，浸泡30 min后至37℃恒温箱烘干备用。

1.2.4.2硝酸纤维素膜(NC)预处理 将NC膜在PBST溶液(含0.5% Tween20和1% BSA，pH7.4)浸泡30 min，37 ℃烘干，备用。

1.2.4.3试纸条组装 使用三维喷金划膜仪将1 mg/mL的OMP22、OMP28混合蛋白和抗OMP22单克隆抗体喷涂在NC膜上，分别作为T线和C线；37 ℃温箱烘干，将样品垫、NC 膜、金标垫、吸水垫粘于PVC无荧光底板上，然后用BIO-DOT切割机将组装好的条子切割成5 mm宽度的试纸条，置于卡槽内加入干燥剂放入巴氏滴管并用密封袋封闭常温避光保存，有效期1年，方便野外现场检测。

1.2.5试纸条灵敏度检测 将布鲁氏菌标准阳性血清用1×PBS缓冲液按照1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128进行梯度稀释。

1.2.6试纸条特异性检测 选用同一批次试纸条对牛源布鲁氏菌血清、牛结核病血清、蓝舌病血清、牛病毒性腹泻血清、口蹄疫血清、牛白血病血清及小反刍兽疫血清，观察结果有无交叉反应。

1.2.7实用性验证和ELISA试剂盒效价评定 使用同一批次试纸条对现场采集的牛、羊各100份血清样品进行检测，同时以标准的ELISA试剂盒(IDEXX)和国家标准检测的虎红平板凝集试验(RBPT)作为参照比，计算两种方法检测结果符合率。对筛出的阳性血清按照1∶10、1∶20、1∶40、1∶60、1∶80、1∶100、1∶200进行梯度稀释用于评价ELISA试剂盒的效价和试纸条的灵敏度。

1.2.8试纸条重复性检测 使用同一批次和不同批次试纸条检测布鲁氏菌标准阳性血清和阴性血清，通过试验结果评价试纸条的批间和批内的重复性效果。

2 结 果

2.1胶体金溶液的鉴定 按照1.2.1方法进行制备胶体金，结果显示，胶体金溶液呈酒红色，经紫外可见分光光度计扫描可知：胶体金横向等离子共振吸收波长在527 nm处，且峰型狭窄，说明该胶体金颗粒均一，分散性好(图1)。

A:40 nm粒径胶体金溶液；B:UV-Vis 扫描光谱图图1 标准胶体金溶液鉴定图谱Fig.1 Standard colloidal gold solution identification map

2.2蛋白标记最适浓度 未加蛋白管和加入蛋白质的量不足以稳定胶体金溶液的各管，均呈现出由红变蓝的聚沉现象，而加入蛋白量达到或超过最低稳定量的各管仍保持红色不变，胶体金溶液红色不变的最低蛋白标记用量为9 μg/mL(图2)。

图2 胶体金标记蛋白最适浓度Fig.2 Optimization concentration determination of gold colloid binding protein

2.3试纸条灵敏度检测 当布鲁氏标准阳性血清稀释度达1∶128时，质控线(C线)和检测线(T线)均显示两条红线，而稀释度低于1∶128时，试纸条呈阴性，因此，该试纸条的灵敏度为1∶128。

2.4试纸条特异性检测 用重组布鲁氏菌外膜蛋白OMP22和OMP28的混合蛋白标记的试纸条检测布鲁氏菌标准阳性血清、牛结核病血清、蓝舌病血清、牛病毒性腹泻血清、口蹄疫血清、牛白血病血清及小反刍兽疫血清。结果显示，除布鲁氏菌标准血清为阳性外，其他均为阴性。

2.5实用性验证和ELISA试剂盒效价评定 用IDEXX试剂盒和国家检测标准的RBPT分别对牛、羊各100份血清样品进行检测，结果显示，用IDEXX试剂盒检出阳性结果40份和阴性结果160份；使用胶体金免疫层析试纸条检测，阳性结果38份和阴性结果162份；以RBPT检测结果作为标准，检出阳性结果39份和阴性结果161份，以IDEXX试剂盒检测结果作为标准，结果试纸条检测的阳性样品全部来自IDEXX试剂盒检测的40份阳性血清样品，即两种检测方法的符合率为95%(38/40)，以RBPT检测结果作为标准，结果试纸条检出的38份阳性样品全部来源于RBPT检测的39份阳性样品，即两种检测方法的符合率为97.4%(38/39)。采用ELISA试剂盒检测不同稀释度的阳性样品，结果显示阳性血清最大稀释度在1∶100时检测结果为阴性，而胶体金试纸条在稀释度为1∶100时仍可检出，表明胶体金试纸条的灵敏度较ELISA试剂盒高。

2.6试纸条重复性检测 使用同一批次和不同批次的试纸条检测布鲁氏菌标准阳性血清和阴性血清，试纸条的批内和批间结果重复性良好。

3 讨 论

布鲁氏菌外膜蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性，在免疫诊断方面彰显成效[14-15]。OMP28在各种属间保守性极高，具有良好的免疫原性，Yong等[16]发现急性反应期患者机体血清中OMP28蛋白抗体表现为阳性，而在恢复期及慢性反应期患者机体血清中OMP28蛋白抗体表现为阴性，表明该蛋白具有作为急性型感染诊断抗原的潜力。Lim等[17]用外膜蛋白OMP28免疫小鼠，发现小鼠体内的IgG1和IgG2的滴度高于空白对照组20倍，并且脾脏的感染度也低，这表明OMP28可诱导机体产生体液免疫和细胞免疫。2013年，有相关研究表明此蛋白可在大肠杆菌中大量表达，继而降低了OMP28蛋白的生产成本，具有良好的市场前景和应用价值[18]。而外膜蛋白OMP22也是一种免疫优势抗原，Cassataro等[19]发现OMP22蛋白可分布于S型布鲁氏菌的表面。也有相关报道[20-21]OMP22蛋白与布鲁氏菌的脂多糖成分相似，均能诱导机体产生免疫反应。Martín-Martín 等[22-23]研究发现缺失OMP22基因的绵羊附睾布鲁氏菌在侵染HeLa细胞和J774.A1细胞时，两种细胞的增殖分裂能力均降低，表明OMP22基因可能与布鲁氏菌的毒性和感染力相关。近而表明外膜蛋白Omp28和OMP22均可作为诊断抗原应用于布鲁氏菌病快速诊断中。

鉴于布鲁氏菌外膜蛋白OMP28和OMP22具有良好的免疫原性和免疫反应性，本研究采用双抗原夹心法建立了一种快速、特异、敏感适用于现场和基层推广的胶体金免疫层析试纸条。刘亚东等[24]研制出的牛源布氏菌重组膜蛋白胶体金免疫层析试纸条具有快速、敏感、特异和重复性好等优点，但是检测目标局限于牛源血清样品，本研究在刘亚东等研究者的基础上进行了改进，采用胶体金标记OMP28和OMP22混合蛋白，将OMP28、OMP22混合蛋白和抗OMP22的单克隆抗体分别作为T线和C线喷涂于NC膜上，可以用于检测牛、羊等动物的血清。本研究将OMP28和OMP22结合既可增强抗原的免疫原性、免疫反应性，也可防止漏检。结果表明该方法制备的试纸条具有良好的特异性和敏感性，不与牛源结核病血清、蓝舌病血清、牛病毒性腹泻血清、口蹄疫血清、牛白血病血清和小反刍兽疫血清发生交叉反应；牛、羊源血清样品检测结果与商品化ELISA试剂盒符合率为95%；检测布鲁氏菌标准阳性血清灵敏度达1∶128。RBPT作为国家标准检测方法从200份样品中筛选出39份阳性样品，胶体金试纸条检测38份阳性样品全部来自39份阳性样品，两种检测方法的符合率为97.4%。说明胶体金试纸条检测的灵敏度高，但偶尔也会有假阳性的结果，可能与下列因素有关：①T线距离结合垫较近；②过量的金标粒子喷涂结合垫；③选用NC膜型号的层析速度过慢。因此，在后续试验中我们需要针对上述问题进行改进。此外，采用双抗原夹心法制备的试纸条有时质控线和检测线结果会偏弱，这是由于金标垫抗原会和检测线上包被的抗原竞争结合样品中的抗原表位，后续我们可以通过金标ProteinA，质控线包被单抗IgG，以此提高检测信号和试纸条的灵敏度。

本研究以牛源布鲁氏菌外膜蛋白OMP22和OMP28作为金标抗原，制备了快速检测布鲁氏菌病的胶体金免疫层析试纸条，相信通过对上述不足条件进一步优化后，可以满足现场大批量样品的初步筛查。

本研究获得了粒径均一，分散良好的胶体金溶液和蛋白标记的最适浓度，并且本研究制备的胶体金试纸条在检测血清抗体方面具有良好的敏感性、特异性及重复性。

利益冲突：无

引用本文格式：孔玉方,郑家昊,王慧煜,等.布鲁氏菌病快速检测试纸条的探索[J].中国人兽共患病学报,2019,35(5):460-464. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.053