量子点标记免疫层析技术检测布鲁氏菌病的方法研究

王升启荣 振王素华姜 海

布鲁氏菌病是一种世界范围内常见的人兽共患疾病，全世界每年有超过50万例新发病例诊断为布鲁氏菌病[1]。该病给养殖生产者和国家造成严重的经济损失，作为生物恐怖病原被一些西方国家用作生物战剂[2]，危害国家安全和人民健康。近年来，布鲁氏菌病的疫情出现回升趋势，并且引发严重的公共卫生问题。传统鉴定布鲁氏菌方法主要以试管凝集试验(SAT)和酶联免疫吸附试验(ELISA)为主。随着科学技术的发展，一些新的方法技术被用到布鲁氏菌的检测中来[3-4]。而以胶体金为标记物的免疫层析方法(GICA)，因操作简单、结果易判读、血清用量少、成本低、无需专业技术人员以及专业设备等优点，广泛应用于布鲁氏菌病的现场检测。量子点(Quantum dots，QDs)作为一种新型的荧光标记材料，因其具有较好的荧光特性，广泛应用于发光生物探针领域量，以用来提高检测灵敏度[5-7]。相较于胶体金免疫层析法，量子点免疫层析技术的应用前景也非常广阔。因此，本研究将量子点代替胶体金，开发一种量子点免疫层析技术，以检测血清中的布鲁氏菌抗体。

1 材料和方法

1.1材料及仪器 硝酸纤维素膜(nitrocellulose membrane，NC膜,型号：HF13502S25)；玻璃纤维素膜(型号：Ahlstrom8964)；血清样品垫(型号：XQ-Y2)；吸水纸(型号：H5072)；PVC底板(型号：DB-6)，以上均购自上海杰一生物技术有限公司；划膜仪(型号：XY1000，Bio-Dot公司)；微电脑自动斩切机(型号：ZQ2000，上海金标生物科技公司)；高功率数控超声清洗仪(型号：KQ-800KDE)；冷冻干燥机(型号：LGJ-10B，北京四环科学仪器厂)；全系列德国eppendorf离心机(型号：C5424)；数控裁条机(型号：CTS300，上海金标生物科技有限公司)。

1.2试剂 牛血清白蛋白(BSA)，含吐温20的磷酸盐缓冲液(PBST)，2-吗啉乙磺酸溶液(Mercaptosuccinicacid，MES)；N-羟基琥珀酰亚胺 (N-hydroxysuccinimide，NHS)；1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC，Sigma公司)；量子点(QDs，表面活性基团为羧基，购自于NanoGen公司)；布鲁氏菌全菌蛋白(由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所提供)；蛋白A(staphylococcal protein A，SPA，Sigma公司)，其他试剂均为分析纯。试验中所用水(18.2MΩ)由Milli-Q纯水系统提供。

1.3样本来源 布鲁氏菌病病人阳性血清、布鲁氏病国家标准阳性血清、正常人阴性血清由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所提供，含炭疽、霍乱抗原血清由军事医学研究院辐射医学研究所分子诊断实验室提供。

1.4 方 法

1.4.1量子点的偶联及包被 取25 μL QDs，加5 μL 0.1 mol/L pH6.0 MES和20 μL去离子水洗涤；加入一定量的交联剂NHS 、EDC 37 ℃下活化30 min；反应结束后离心弃上清液，加入10 mol/L MES的溶液重悬至量子点原始体积，加入一定量的布鲁氏菌全菌蛋白溶液充分反应，使用BSA进行封闭，待封闭完成离心后弃去上清液，根据需要稀释至合适浓度均匀喷涂在释放垫上，冷冻干燥3～4 h。

1.4.2硝酸纤维素膜的包被 将SPA和布鲁氏菌全菌蛋白稀释至所需浓度，分别作为C线(质控线)和T线(检测线)，将膜置于相对湿度20%，温度37 ℃条件下干燥2.5～3 h。

1.4.3试纸条的组装 将样品垫、释放垫、层析膜、吸收垫相互重叠1～1.5 mm粘贴在PVC底板上。其中样品垫和结合垫为玻璃纤维素膜，层析膜采用硝酸纤维素膜，吸水纸采用吸水滤纸，试纸条结构见图1。将组装好的试纸条切割成长6.5 cm、宽3.5 mm，加入干燥剂后室温密封保存。

1.4.4检测原理及结果判定 本研究采用双抗原夹心法，检测过程如下：将待测样品滴加到样品垫上，当样品中存在布鲁氏菌抗体时，会和释放垫上QDs标记物结合，形成QDs-Ag-抗体免疫复合物，流经检测线时，该免疫复合物和固定在检测线上的抗原结合，发生特异性免疫反应，此时一部分量子点固定在检测线上，形成T线。未与抗原发生反应的免疫复合物继续向前迁移，流经质控线时被固定的二抗(SPA)捕获，发生免疫反应，形成C线。多余的QDs标记物则会迁移，最终停留在吸收垫处。

以布鲁氏菌病阳性血清为样品,滴加70 μL到试纸条样品垫，反应10 min后在紫外灯照射下查看结果。若C线出现红色条带，T线无条带，判定为阴性；若C线和T线均出现红色条带，判定为阳性；若C线无条带，不论T线有无条带均视试纸条无效。

图1 量子点免疫层析试纸条模型图Fig.1 Mmodel diagram of a quantum dot immunochromatographic strip

1.5试纸条的初步性能评价试验 将阳性血清(1∶3 200)稀释成不同浓度滴加到样品垫上，以PBST稀释的BSA和正常人阴性血清作对照进行检测，出现荧光条带的血清最高稀释度作为试纸条的灵敏度。同时检测牛血清白蛋白、炭疽阳性血清、霍乱阳性血清、正常人阴性血清、布鲁氏菌病阳性血清，判断该试纸条有无非特异性。将102份布鲁氏菌病阳性血清和47份健康人阴性血清分别使用试纸条和试管凝集试验进行检测，计算两种方法的符合率。

2 结 果

2.1试纸条的优化 本研究从QDs用量、抗原标记使用量、抗原包被量、封闭时间、封闭剂用量等方面进行了优化。根据荧光亮度确定T线、C线的包被浓度分别为2 mg/mL、1 mg/mL，固定喷涂T线、C线的包被量分别设置为0.6 μL/cm、1 μL/cm。当QDs标记的抗原使用量为15 μL时，T线荧光最强，而在使用量分别为10 μL、20 μL时，荧光强度出现下降趋势，分析可能是抗原过少未能与QDs完全偶联，抗原过多抑制QDs偶联效率。当封闭剂加入量为25 μL、封闭时间为3 h时，试纸条的荧光效果最好。最后对QDs用量进行了优化，使用25 μLQDs可使其荧光最强。后续试纸条性能评价试验均采用上述优化参数进行检测。

2.2重复性实验结果 该试纸条重复性较好，紫外灯照射下阳性、阴性血清无特异性出现，并且阳性血清T线亮度没有出现下降的趋势。

2.3特异性试验结果 该试纸条检测牛血清白蛋白、炭疽阳性血清、霍乱阳性血清、正常人阴性血清T线位置均无条带；检测布鲁氏菌病阳性血清T线位置出现条带，证明该试纸条无特异性出现。

2.4灵敏度试验结果 使用试纸条分别检测原液、稀释为2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、128倍8种不同浓度阳性血清，在紫外灯照射下不同稀释倍数阳性血清均出现T线(见图2)。

(从左到右依次为原液、2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、128倍)图2 试纸条灵敏度试验结果图Fig.2 Test results of strip sensitivity

2.5试纸条性能初步评价结果 经试管凝集试验及量子点免疫层析试纸条检测，试纸条检测敏感性为99.0%，特异度为95.8%，两种方法符合率为98.0%,见表1。

表1 两种不同方法检测病例结果Tab.1 Cases tested with different methods

量子点标记试纸条试管凝集试验+-合计+1002102-14647合计10148149

2.6试纸条稳定性结果 用同一批次制备的试纸条分别在第5、10、15、20、25、30、35 d时检测布鲁氏菌病阳性血清，用干式免疫荧光分析仪对试纸条读取T值，重复3次检测并取平均值(见图3)，其变异系数为4.1 %，表明量子点免疫层析试纸条检测布鲁氏菌病抗体重复性好，一个月的保存期内稳定性良好。

图3 量子点试纸条稳定性试验Fig.3 Stability test of paper strip with quantum dots

3 讨 论

近年来，量子点作为一种优异的荧光标记物引起人们的重视，因其具有较宽的吸收峰，较高的荧光强度，稳定性好等特点，与传统发光材料相比具有更优越的性能，是一种极具潜力的荧光探针制备物，在生物领域和医学免疫方面得到飞速的发展，已广泛应用于副溶血弧菌[8]、C反应蛋白[9]的检测和非洲猪瘟[10]、中东呼吸综合征[11]等传染病的快速诊断研究。目前在生物领域使用的免疫层析试纸条多以胶体金为标记物，其普遍存在灵敏度低、易现假阳性等问题。本研究所制备的量子点免疫层析试纸条是基于免疫层析技术和抗原-抗体特异性反应建立的快速检测布鲁氏菌病抗体的方法，其过程是将金黄色葡萄球菌A蛋白与布鲁氏菌全菌蛋白固定于硝酸纤维素膜，量子点与全菌蛋白偶联物稀释后与释放垫冷冻干燥，构建免疫层析系统，组装量子点免疫层析试纸条检测布鲁氏菌抗体。该法不仅结合了免疫反应与层析技术准确快速的优点，同时选择了能与布鲁氏菌抗体特异性结合的布鲁氏菌抗原，相比于胶体金试纸，由于量子点基于荧光显色，因而其抗干扰性更强，检测限更低。同时该试纸条应用范围广，可针对感染布鲁氏菌的人或动物进行检测，相较于市场现有的仅用来检测动物布鲁氏菌病的胶体金试纸条，其更加具有应用价值。

本研究对试纸条制备条件进行了优化，设计制成了量子点标记免疫层析试纸条，用于检测血清中布鲁氏菌抗体，在15 min内即可实现对布病的检测。血清用量少，当使用10 μL人或动物血清，依旧可以对其进行检测。本实验结果证明，量子点免疫层析试纸条是一种特异性强的检测方法，分别滴加正常人阴性血清、胎牛血清、炭疽阳性血清、霍乱阳性血清均无非特异。朱明东等[12]使用胶体金免疫层析法检测人血清的研究中，当血清用量为10 μL时，敏感性和特异性分别为93.6%和94.9%；另一篇关于胶体金法检测布鲁氏菌的研究中[13]，采集某市地方病防治中心布病门诊的就诊者血清，以布鲁氏菌分离培养作为确诊布病的“金标准”进行检测。结果显示，该课题组自制的胶体金诊断试剂盒对确诊病人诊断的灵敏度为94.12%，特异度为79.41%，该试剂盒与布病诊断“金标准”比较Kappa值为0.724，符合率为86.76%。Wang[14]等以SAT法作为金标准，GICA法灵敏度和特异度分别为94.1%和81.0%。总符合率达到88.5%。在本研究中，以试管凝集试验作为布病确诊的“金标准”，使用自制的量子点免疫层析试纸条对149例临床血清进行检测，结果显示其敏感度为99.0%，特异度为88.9%，两种方法符合率为98.0%。从本次研究检测布鲁氏菌病中，敏感性、灵敏度等均较高，但是由于收集病例较少，因此后期还需要加大样本量继续验证灵敏度。

随着科学技术的发展，布鲁氏菌的现场快速检测技术已经有了很大的进展。本试验利用量子点标记的免疫层析试纸条检测布鲁氏菌病，不论是在试验仪器的使用，检测时间的时长，检测技术的应用等方面，以及对检测布鲁氏菌病敏感性与特异性上都具有显著的优势。该方法与试管凝集试验相比，仍然具有操作便捷、省时省力、灵敏度髙、特异性强等优点。本研究方法制备的量子点免疫层析试纸条将布鲁氏菌全菌蛋白作为标记抗原，其在目标血清检测方面应用更加广泛，具有便携、高灵敏度、检测时短、特异等优点，更适合于布鲁氏菌病诊断、流行病学调查及现场应用，同时在牧区布鲁氏菌病检测、疫情控制等方面提供一种新的检测方法。

利益冲突：无

引用本文格式：李广强,王升启,荣振,等.量子点标记免疫层析技术检测布鲁氏菌病的方法研究[J].中国人兽共患病学报,2019,35(5):389-392，398.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.049