黄精多糖通过调节JAK2/STAT3通路改善异丙肾上腺素诱导的大鼠心肌肥厚

方欢乐，李瑶瑶，陈晶晶，安 昌，陈渝婷，杨永华

0 引言

心血管疾病(Cardiovascular diseases，CVD)如高血压、冠心病是危害人类健康的首要疾病[1-2]。心肌肥厚导致心脏重塑是引发多种CVD发生率升高的重要因素。因此，临床治疗心血管疾病的重点是减缓甚至逆转心脏重塑，这对于改善患者的长期生存至关重要[3-4]。酪氨酸蛋白激酶/信号转导子和转录激活子(Janus activated kinase signal transducer and activator of transcription，JAK2/STAT3)信号通路是心肌细胞增殖、分化的重要通路，其活性的改变与心肌肥大有着密切关联[5-6]。黄精为百合科植物滇黄精或多花黄精的干燥根茎，其主要活性成分为黄精多糖(Polygonatumsibiricum polysaccharides，PSP)。研究表明，黄精多糖药用价值非常高，具有抗肿瘤、抗氧化、免疫调节、抑菌、抗炎等活性[5]。近年研究表明，黄精多糖干预可抑制炎症因子的释放，减轻心肌损伤程度，改善心肌梗死[7]。黄精多糖可清除心肌组织中过量的氧自由基，提高抗氧化酶的活性[8]。本课题前期实验研究表明，黄精多糖可通过抗炎调节细胞黏附分子ICAM-1和VCAM-1蛋白表达，改善小鼠心室重塑[9]。但异丙肾上腺素(Isoproterenol,ISO)诱导心肌肥厚过程中活化JAK2/STAT3通路，黄精多糖是否通过阻断JAK2/STAT3通路保护心肌组织，目前尚未见报道。本研究通过给大鼠皮下注射异丙肾上腺素制作心肌肥厚模型，观察黄精多糖抑制JAK2/STAT3通路改善心肌肥厚的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 60只SPF级SD雄性大鼠，体重(180±20)g，购买于中国人民解放军第四军医大学实验动物中心，许可证编号：SCXK(军)2017-0007。

1.1.2 药物与试剂 黄精多糖(多糖含量≥90.0%)，南京景竹生物科技公司。普萘洛尔片，天津力生制药股份有限公司，批号：20141015；ISO，美国Sigma公司，批号：150513；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化脂质(LPO)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)试剂盒由南京建成生物工程研究所提供，生产批号：1710150、1710181、1710151；抗体JAK2、P-JAK2、STAT3、P-STAT3 由Abcam公司提供。

1.1.3 仪器 MK3全自动酶标仪(赛默飞世尔公司)；XSP-2C数码生物显微镜(深圳市西尼科光学仪器有限公司)；垂直电泳槽、湿电转膜仪(Bio-Rad伯乐，USA)；Tanon-5200全自动荧光/化学发光成像系统，上海天能科技有限公司。

1.2 动物模型及分组给药 异丙肾上腺素背部皮下注射5 mg/(kg · d)，1次/d，连续给药14 d，建立大鼠的心肌肥厚模型[10]。取SD雄性大鼠60只，随机分为6组，即对照组，模型组(ISO组)，黄精多糖低、中、高剂量组，普萘洛尔组，每组10只。对照组每日1次皮下注射0.9% NaCl，模型组及其他组溶解ISO(5 mg/kg)在生理盐水中，皮下注射连续给药14 d造心肌肥厚模型；造模后第2天开始，黄精多糖低、中、高剂量组分别按照200、400、800 mg/kg每天灌胃给药，普萘洛尔组150 mg/kg灌胃给药。给药0.5 h后皮下注射ISO，连续给药治疗1个月。大鼠的体重每4天记录1次。在实验结束前1 d禁食，自由饮水。

1.3 大鼠心脏重量参数测定 称量大鼠体重(BW)，麻醉，腹主动脉取血后，取出心脏，PBS清洗残血，滤纸吸干后称量全心重(HM)，计算心重指数(Heart mass index，HMI=HW/BW)。分离左心室，称取重量，计算左室重量指数(Left ventricular mass index，LVMI)，即左心室重量(LVW)与体重(BW)的比值(LVW/BW)。

1.4 大鼠心脏标本形态学检测 取大鼠心脏标本，切取左心室约50 mg，放置在10%甲醛溶液中固定，24 h后取出心脏用蒸馏水反复冲洗，梯度乙醇溶液脱水后过夜，用石蜡包埋、切片进行苏木素-伊红(HE)染色。数码生物显微镜下观察大鼠心肌组织病理学改变、照相分析。

1.5 大鼠血清生化指标检测 大鼠用20%乌拉坦溶液麻醉，腹主动脉取血，EP管收集血液5 ml左右。使用离心机3 600 r/min离心20 min，取上清液，按照试剂盒说明检测氧化应激指标SOD、MDA、GSH-Px、LPO的含量。

1.6 酶联免疫吸附试验(ELISA)测定炎性指标TNF-α、IL-6浓度 取血，离心方法参照“1.5”项。采用双抗体夹心ABC-ELISA法测定TNF-α、IL-6浓度，检测450 nm处OD值，实验操作步骤按试剂盒说明书方法进行。

1.7 Western blot法测定心脏组织中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3的表达情况 取各组部分心脏组织加入裂解液，于冰浴上进行匀浆裂解，12 000 r/min低温离心15 min。取上清液BCA法测定蛋白浓度。应用8%PAGE上胶分离上样蛋白，湿法转移至PVDF膜上。5%脱脂牛奶37 ℃封闭膜45 min。取出分别加入特异性抗体JAK2、STAT3(1∶200)、p-JAK2、p-STAT3(1∶500)、GAPDH(1∶5 000)，孵育1 h后4 ℃过夜。次日TBST洗膜，加入二抗，孵育45 min后洗膜。加化学发光试剂孵育，暗室发光。照片用Gel-Pro Analyzer 4.0 software分析。

2 结果

2.1 黄精多糖对心肌肥厚大鼠心脏质量指数和左心室指数的影响 ISO皮下注射致大鼠心肌肥厚，结果显示，模型组大鼠HMI、LVMI较对照组显著增加(P<0.01)，表明模型建立成功。用药物治疗1个月后，与模型组比较，高剂量黄精多糖和普萘洛尔可显著抑制大鼠心脏指数及左心室指数的增加(P<0.05，P<0.01)。见表1。

表1 黄精多糖对心肌肥厚大鼠心脏质量指数和左心室指数的影响

注：与模型组比较，*P<0.05，* *P<0.01

2.2 黄精多糖对心肌肥厚大鼠心肌组织形态学的影响 大鼠心肌组织HE染色结果显示，对照组大鼠心肌细胞形态正常、排列紧密。与对照组比较，模型组大鼠心肌细胞增大、间隙增宽。药物治疗后，黄精多糖中、高剂量组及普萘洛尔组心肌细胞形态相对正常，细胞排列紧密(与对照组比较)，表明药物具有保护受损的心肌细胞的作用。见图1。

2.3 黄精多糖对心肌肥厚大鼠血液中SOD、GSH-PX、MDA、LPO 活性的影响 由表2可知，与对照组比较，模型组大鼠血液中脂质氧化产物MDA、LPO含量明显增加，抗氧化产物SOD、GSH-PX含量显著下降(P<0.05，P<0.01)。与模型组比较，黄精多糖中剂量组MDA、LPO含量降低(P<0.05)，中剂量组GSH-PX含量升高(P<0.05)，高剂量组及普萘洛尔组SOD、GSH-PX含量升高(P<0.05，P<0.01)，中、高剂量组及普萘洛尔组MDA、LPO含量降低(P<0.05，P<0.01)。

图1 各组大鼠心肌组织光镜下病理形态学改变(HE，400×)

表2 黄精多糖对心肌肥厚大鼠血液中SOD、GSH-PX、MDA、LPO 活性影响

注：与模型组比较，*P<0.05，* *P<0.01

2.4 黄精多糖对心肌肥厚大鼠血TNF-α、IL-6含量的影响 模型组大鼠血TNF-α、IL-6含量高于对照组(P<0.01)。与模型组比较，黄精多糖中、高剂量组及普萘洛尔组大鼠血TNF-α、IL-6含量降低(P<0.01，P<0.05)。见表3。

表3 黄精多糖对心肌肥厚大鼠血液中TNF-α、IL-6含量的影响

注：与模型组比较，*P<0.05，* *P<0.01

2.5 黄精多糖对心肌肥厚大鼠心脏组织中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表达的影响 白细胞介素(IL)-6可使得JAK2磷酸化而激活，磷酸化的JAK2催化其下游STAT3发生磷酸化后，引发心肌肥厚[11]。本研究进一步检测了心肌肥厚大鼠心脏组织中JAK2、p-JAK2 和STAT3、p-STAT3 蛋白表达。结果显示，与对照组比较，模型组p-JAK2和p-STAT3蛋白表达提高(P<0.05，P<0.01)。与模型组比较，黄精多糖中、高剂量组及普萘洛尔组p-JAK2、p-STAT3蛋白表达下调(P<0.05，P<0.01)。见图2。

3 讨论

临床研究表明，心肌肥厚是引起心血管疾病发生率显著升高的重要危险因素，早期的心肌肥大具有一定的代偿意义，但持续加重的心肌肥大终将导致心力衰竭的发生[11-12]。异丙肾上腺素通过激活动物肾上腺素受体促进多种信号转导通路，刺激心肌细胞内相关蛋白的合成及表达，引起胶原沉积出现心肌肥厚。模拟这一失代偿过程，可观察到心脏体积增大、心肌细胞肥大、氧化代谢异常，心肌中促炎因子表达增加[13-14]。促炎因子如TNF-α、IL-6等参与心肌肥厚的发生[15]，调控细胞增殖、分化、生长及代谢等。

图2 各组大鼠心脏组织中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 蛋白表达

炎症可进一步引起内皮细胞损伤、活性氧产生，导致机体氧化平衡系统失衡，活性氧清除功能降低，使氧自由基大量堆积[16]。近年研究表明，黄精多糖可减轻炎症反应、提高氧自由基清除能力，对急性心肌梗死模型大鼠心肌损伤有保护作用[17]。本研究显示，与对照组比较，异丙肾上腺素引发的心脏肥厚过程中心脏体积增大、心体重比增高，HE染色的心肌细胞肥大，抗氧化指标SOD、GSH-PX减少、脂质氧化产物MDA、LPO增多，炎症标志物IL-6、TNF-α含量明显升高。治疗1个月后，与模型组比较，黄精多糖中、高剂量组各项指标均得到改善，表明黄精多糖具有一定的抗氧化抗炎、改善心肌肥大作用。

心肌肥厚是慢性心力衰竭主要的病理改变之一，其中 JAK/STAT信号通路是引起心力衰竭心肌重塑改变的重要发病机制，血清 JAK水平是反映心肌肥厚、心肌重塑程度的指标[18]。JAK/STAT途径主要在心肌细胞中发现，是连接细胞表面受体到细胞核转录的一种直接信号传导途径。在导致心肌细胞肥大的各种病理情况下，该途径可被一些细胞分裂素和生长因子激活，在心肌肥厚形成过程中具有重要意义[19-20]。Western blot检测结果显示，模型组心肌细胞中p-JAK2、p-STAT3表达上调；黄精多糖中、高剂量组可以抑制异丙肾上腺素引起的p-JAK2、p-STAT3表达增加，提示黄精多糖可能通过抑制JAK2/STAT3信号传导通路的激活来减轻心肌肥厚程度和炎症反应，产生保护心脏作用。

综上所述，黄精多糖对异丙肾上腺素诱导的大鼠心肌肥厚有一定保护作用。