牡蛎酶解工艺的响应面优化研究

张典，李龄佳，崔春*，刘鹏展，郑雪君，许立锵

(1.华南理工大学 食品科学与工程学院，广州 510640；2.广东真美食品 股份有限公司，广东 潮州 521000)

牡蛎又名生蚝、海蛎子等，其肉嫩味鲜，营养丰富，富含氨基酸、多不饱和脂肪酸、维生素以及矿物质，有“海中牛奶”和“海之玄米”的美誉[1,2]。现代医学研究发现牡蛎及其提取物具有抑菌、降血脂、降血压、抗氧化、抗肿瘤等多种生理活性，因此在食品及药用方面都具有极高的应用价值[3-5]。但由于水产品存在较难保鲜、传统加工技术利用率低的问题，牡蛎的高产值应用及行业发展均受到了限制。因此，研究新型的深加工技术对牡蛎产业的健康发展至关重要[6]，在众多的新型加工技术中，酶处理技术作用条件温和，反应过程易于控制且可以较好地保留氨基酸等营养物质，因此得到了广泛的关注[7]。

当前针对牡蛎多采用单酶水解法，酶解产物常常存在氨基酸态氮含量低、蛋白质回收率不高等问题[8]。为解决以上问题，提高牡蛎蛋白质的利用率，本实验采用胰蛋白酶和风味蛋白酶双酶协同的方法酶解牡蛎，并利用响应面法获得酶解过程的最佳工艺参数，以期为牡蛎的高效利用提供一定的理论依据[9]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜牡蛎：购自广州黄沙海鲜水产市场；胰蛋白酶：酶活2.65×105U/g，广州明远工贸有限公司；风味蛋白酶：酶活500 LAPU/g，诺维信(中国)公司；其他实验试剂：均为市售分析纯。

1.2 仪器与设备

善美SM-G21型绞肉机 广州新域机电制造有限公司；THZ-82恒温振荡器 常州国华电器有限公司；HYP-308消化炉、KDN-103F型微量凯氏定氮仪 上海纤检仪器有限公司；高速冷冻离心机 长沙湘智离心机仪器有限公司；电子分析天平 梅特勒-托利多国际股份有限公司；pH-3E pH计 上海雷磁仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 原料处理

新鲜牡蛎去壳后，用绞肉机制成肉糜，将牡蛎肉糜与去离子水按照质量比 1∶1的比例混合形成混合液备用。

1.3.2 牡蛎酶解

称取一定量的牡蛎混合液于锥形瓶中，在自然pH[10,11]、特定的酶用量(%，胰蛋白酶和风味蛋白酶配比为3∶1)，特定的温度下水浴震荡酶解一定时间，反应终止后在沸水浴中灭酶20 min。酶解液离心10 min(12000×g)，取上清液过滤，收集滤液，并测定其蛋白回收率和水解度[12,13]。

1.3.3 单因素试验

在固定其他因素相同的条件下，分别考察各单因素酶用量(%)、酶解时间(min)和酶解温度(℃)对蛋白质回收率和蛋白质水解度的影响[14]。

1.3.4 响应曲面法优化牡蛎酶解工艺

根据Box-Benhnken原理设计优化试验，以酶用量(%)、酶解时间(min)、酶解温度(℃)为单因素试验的考察变量，以蛋白质水解度和蛋白质回收率为优化响应值，采用三因素三水平的响应面分析法优化酶解条件，因素水平安排见表1。

表1 响应面试验因素水平表Table 1 Levels and factors of response surface test

1.3.5 蛋白回收率和水解度的测定

使用凯氏定氮法测定原料和酶解液的总氮含量，用中性甲醛滴定法测定氨氮含量，蛋白回收率定义为牡蛎酶解液中的蛋白总量与原料蛋白总量的比值；水解度定义为牡蛎酶解液中的游离氨氮量与原料总氮量的比值[15]。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 酶用量对酶解效果的影响

酶解温度为50 ℃，酶解时间为6 h，酶用量对酶解效果的影响结果见图1。

图1 不同加酶量的酶解效果Fig.1 Enzymatic hydrolysis effect of different additive amount of enzyme

由图1可知，酶添加量小于0.3%时，牡蛎酶解液的蛋白质回收率和蛋白质水解度随酶添加量的增大而明显升高，当继续增大酶添加量时，蛋白质水解度和蛋白质回收率增长趋于平稳，其原因可能是酶用量较低时，酶与底物结合较充分，蛋白质水解程度随酶添加量的增加而增大，而当酶用量大于0.3%时，酶的浓度达到饱和，酶的作用效果也明显减弱，因此，酶用量以0.3%为宜[16]。

2.1.2 酶解时间对酶解效果的影响

酶添加量为0.2%，酶解温度为50 ℃，酶解时间对酶解效果的影响结果见图2。

图2 不同酶解时间的酶解效果Fig.2 Enzymatic hydrolysis effect of different enzymolysis time

由图2可知，随着酶解时间从3～6 h，蛋白质水解度和回收率呈明显上升趋势；在酶解时间达到6 h后，延长酶解时间对蛋白质酶解效果影响变小。其原因可能是在6 h,绝大部分蛋白质已经充分水解[17]。因此，酶解时间以6 h为宜。

2.1.3 酶解温度对酶解效果的影响

酶添加量为0.2%，酶解时间为6 h，酶解温度对酶解效果的影响结果见图3。

图3 不同酶解温度对酶解效果的影响Fig.3 Effect of different enzymatic temperatures on enzymatic hydrolysis effect

由图3可知，当酶解温度小于50 ℃时，蛋白质水解度和回收率随着温度的升高而显著增大；当温度超过50 ℃时，酶的空间结构受到破坏，部分蛋白酶失去活性，蛋白质水解程度降低[18]。因此，酶解温度以50 ℃为宜。

2.2 响应面分析试验

2.2.1 试验设计及结果

根据单因素试验结果，试验设计及结果见表2。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Design and results of response surface test

使用Design Expert (Trial Version 8.0.5)来进行三因素三水平响应面优化设计，总共有18个试验点，其中12个为试验点，6个为中心点，以估算误差。利用二次回归方程对表2中18个试验点的响应值和因素进行数据拟合，得到以下数学模型：

水解度Y1=35.83+3.58A-0.036B+3.97C-2.39AB+0.98AC-1.47BC-4.50A2-9.66B2-3.47C2。

蛋白质回收率Y2=68.65+7.28A+8.50B+6.42C-3.42AB+5.58AC-3.03BC-10.61A2-11.40B2-10.00C2。

2.2.2 响应面优化结果分析

BBD试验设计回归模型分析结果见表3和表4。

表3 蛋白质水解度的响应面二次模型方差分析Table 3 Response surface quadratic model variance analysis of protein hydrolysis degree

表4 蛋白质回收率的响应面二次模型方差分析Table 4 Response surface quadratic model variance analysis of protein recovery rate

注：“*”代表5%显著性水平，“**”代表1%显著性水平，“***”代表0.1%显著性水平。

由表3和表4可知，这2个模型的F值分别为185.28和50.21，对应的P值均小于0.0001，说明这2个数学模型具有高度显著性；失拟项(lack of fit)表示模型预测值与实际值不拟合的概率，上表中失拟项均大于0.05，说明模型失拟不显著；模型复相关系数R2分别为99.52%和98.26%，表明有大约0.48%和1.74%的总量变异不能由模型进行解释；变异系数分别为2.63%和5.01%，说明数据离散程度小；2个模型的信噪比(Adeq Precision)均大于4。上述参数说明实验值和预测值之间具有很好的拟合度，这2个模型因素水平区间设计合理，可用于对牡蛎酶解物的制备工艺实验进行分析、预测。对于蛋白质水解度模型，A(加酶量)、C(时间)、AB、BC、A2、B2、C2对结果有极显著性影响，AC有显著影响，B(温度)对蛋白质水解度不显著；对于蛋白质回收率模型，A(加酶量)、B(温度)、C(时间)、AC、A2、B2、C2对结果有极显著影响，AB有显著影响，BC对蛋白质回收率不显著。由F值和P值可知，一次项中，时间和加酶量对蛋白质水解度影响最大，温度影响最小，但温度却是影响蛋白质回收率的最主要因素。由此可知，各个因素对蛋白质水解度和蛋白质回收率的影响不是简单的线性关系[19]，响应曲面图见图4。

(a)温度和加酶量对蛋白质水解度的影响

(b)加酶量和时间对蛋白质水解度的影响

(c)温度和时间对蛋白质水解度的影响

(d)温度和加酶量对蛋白质回收率的影响

(e)时间和加酶量对蛋白质回收率的影响

(f)温度和时间对蛋白质回收率的影响

由图4中(a)可知，随着温度和加酶量的升高，牡蛎酶解液的蛋白质水解度逐渐上升，在50～53 ℃，加酶量在0.3%～0.4%之间蛋白质水解度有最大值。由图4中(b)可知，随着酶解时间的增长，加酶量的增加，蛋白质水解度逐渐变大，但是当酶解时间超过7 h，加酶量超过0.4%时，蛋白质水解度的增长趋于平缓；在整个酶解过程中，随着酶解时间的延长，蛋白质水解度逐渐上升并趋于平缓，甚至有些下降。由图4中(c)可知，温度在50～53 ℃范围内，蛋白质水解度有最大值，随着酶解时间的延长，蛋白水解度先增加后趋于平缓。由图4中(d)可知，随着温度的增加和加酶量的增大，蛋白质回收率均呈上升趋势，温度在50～53 ℃，蛋白质回收率有最大值，加酶量在0.4%后，蛋白质回收率增长缓慢。由图4中(e)可知，随着酶解时间增加到一定值，牡蛎酶解液的蛋白质回收率随加酶量的添加呈现上升至平缓的趋势，同样的加酶量增大到一定值时，牡蛎酶解液的蛋白质回收率随酶解时间的延长增加到平缓。由图4中(f)可知,牡蛎酶解液的蛋白质回收率随酶解温度和酶解时间的增加到平缓。

利用软件对实验结果进行响应面最优化，在酶解温度为50 ℃，胰蛋白酶添加量为0.3%(E/S)，酶解时间为6 h的条件下，将酶解液的蛋白水解度优化目标设定为maximize的最大值，将蛋白质回收率优化目标设定为maximize的最大值得到蛋白质回收率与蛋白质水解度均高的牡蛎酶解工艺：酶解时间7.04 h,酶解温度50.14 ℃，加酶量0.39%，此时蛋白质水解度和蛋白质回收率分别为37.82%和71.87%。

3 结论

本试验采用胰蛋白酶和风味蛋白酶双酶法协同酶解牡蛎，在单因素试验基础上采用响应曲面法优化牡蛎酶解工艺。试验结果表明：采用响应曲面法优化所得到的试验模型拟合度良好，具有一定的实际应用和研究参考价值，结合试验实际操作条件，其响应面优化的提取工艺参数为：酶解时间7.04 h,酶解温度50.14 ℃，加酶量0.39%，此时蛋白质水解度和蛋白质回收率分别为37.82%和71.87%。