紫皮石斛抗小鼠体力疲劳作用*

董寿堂， 杨 娇， 张旭强， 胡 燕， 杨红芹

(1. 保山中医药高等专科学校, 云南 保山 678000； 2. 大理大学药学与化学院, 云南 大理 671000)

紫皮石斛(Dendrobium devoninum Paxt)又名齿瓣石斛、紫皮兰、大黄草，为兰科石斛属植物，其性味甘、微寒，具有养胃生津、滋阴除热功效，主要用于阴伤津亏、口干烦渴、食少干呕、病后虚热、目暗不明等[1-2]。研究发现，紫皮石斛中含有多种氨基酸、联苄类、菲类、微量元素、多糖等化学物质，具有抗氧化、抗菌及增强免疫力的作用[3-8]。但目前人们主要研究紫皮石斛的栽培、种植，而对紫皮石斛的现代药学研究比较少，导致紫皮石斛的研究开发受到一定的限制。本文以紫皮石斛的功效、化学成分、药理作用为理论依据，并结合保健食品研制思路与方法，探究紫皮石斛的抗体力疲劳作用，为进一步研究和开发紫皮石斛奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

紫皮石斛购于云南省保山市龙陵天和土特产商贸发展有限公司，60%乙醇购于云南省大理州博源化工厂，人参皂苷购于西安普瑞斯生物工程有限公司，小鼠乳酸(Lactate)、小鼠尿素氮(blood uria nitrogen, BUN)、小鼠肝糖原(Glycogen)Elisa试剂盒均购于上海润裕生物科技有限公司。

1.2 仪器与材料

电热鼓风干燥箱(上海一恒科技仪器有限公司)，YF-150高速中药粉碎机(浙江省瑞安市永历制药机械有限公司)，RE-5220旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，PB153-S精密分析天平(瑞士METTLERTOLEDO)，EL304型电子分析天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)，DY89-Ⅱ型电动玻璃匀浆机(宁波新芝生物科技股份有限公司)，TL-16R型台式高速冷冻离心机(上海市离心机机械研究所)，BCD-539WT冰箱(中国海尔集团)，Milli-Q超纯水机(Millipore，USA)，3-15台式高速离心机(美国sigma)，Synergy HT多功能酶标仪(美国BioTek)，311-CO2恒温培养箱(美国Thermo Scientific Forma)，移液器(美国 Thermo Fisher Scientific)，铅丝，温度计。

1.3 动物

昆明种小鼠，雄性，体重(18～22)g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，合格证号：SCXK(湘)2013-0004。

1.4 紫皮石斛的提取

取适量紫皮石斛，于55℃干燥箱中干燥6 h，经粉碎机粉碎后，电子天平称重为8664.0 g，用60%乙醇冷浸5次，每次3 d，然后合并滤液，经旋转蒸发仪减压浓缩，得到浸膏 2570.4 g，提取率为29.67%，其浓度为2.81 g/ml，即1 g相当于 3.37 g的生药。置于4℃下密封保存，备用。

1.5 紫皮石斛给药剂量的确定及其溶液的制备[9]

根据小鼠对紫皮石斛最大耐受量为52.56 g/kg·d-1生药，并依据《中药药理研究方法学》所述，紫皮石斛的安全剂量为最大耐受量的1/3，即为本实验的中剂量17.52 g/kg·d-1生药，然后以二倍比法得到高剂量35.04 g/kg·d-1生药及低剂量8.76 g/kg·d-1生药。以给药体积0.2 ml/10 g，紫皮石斛高、中、低剂量的浓度应分别为1.752 g/ml生药、 0.876 g/ml生药、0.438 g/ml生药。

1.6 溶液的制备

1.6.1 人参皂苷溶液制备 以给药剂量200 mg/kg·d-1、给药体积0.2 ml/10 g为依据，即应配制成1%的溶液。取 81.43%人参皂苷适量，用蒸馏水配制成所需浓度。

1.6.2 0.01mol/L的PBS配制 分别精密称取KH2PO40.27 g、Na2HPO41.42 g、NaCL 8 g、KCL 0.2 g，加去离子水约800 ml充分搅拌溶解后，用盐酸或氢氧化钠将pH值调至 7.2～7.4，然后定容到1000 ml，备用。

1.7 动物分组及给药

取雄性昆明种小鼠50只，适应环境3 d，按体重随机分成5组，每组10只，分别为空白对照组，人参皂苷组，紫皮石斛高、中、低剂量组。空白对组给予等体积的生理盐水，人参皂苷组给药剂量为200 mg/kg·d-1，紫皮石斛高、中、低剂量组给药剂量分别为35.04 g/kg·d-1生药、17.52 g/kg·d-1生药、8.76 g/kg·d-1生药，每天灌胃1次，连续15 d。

1.8 小鼠负重游泳实验

各组同一小鼠于末次给药30 min后，将相当于小鼠体重5%的负荷铅丝系于1/3尾部，把小鼠放入水温(25±0.5)℃，水深为30 cm水池(50 cm×50 cm×40 cm)中，然后进行负重游泳。游泳期间如有弓腰停止、悬浮休息者，用玻璃棒刺激游动以防止偷懒。记录小鼠从放入水池至小鼠沉入水10 s未能浮在水面上的时间，即为小鼠负重力竭游泳时间。

1.9 小鼠血清尿素氮含量测定

各组同一小鼠于末次给药30 min后，将小鼠放入温度为30℃的水池(50 cm×50 cm×40 cm)中不负重游泳90 min，休息30 min后摘眼球采血0.5 ml(不加抗凝剂)，置4℃冰箱约3 h，血凝固后2 000 r/min离心15 min，取血清备用。然后按照试剂盒说明书检测血清尿素氮的含量。

1.10 小鼠血清乳酸含量测定

各组同一小鼠于末次给药30 min后，将小鼠放入温度为30℃的水池(50 cm×50 cm×40 cm)中不负重游泳10 min，休息20 min后摘眼球采血0.5 ml(不加抗凝剂)，置4℃冰箱中过夜后于1 000 g/min离心20 min，取血清备用。然后按照试剂盒说明书检测血清乳酸的含量。

1.11 小鼠肝糖原含量测定

各组同一小鼠于末次给药30 min后，颈椎脱臼处死动物，取肝脏经生理盐水漂洗后用滤纸吸干，精密称取500 mg，加入PBS，用组织匀浆机匀浆制成10%浆液，以3 000 r/min离心20 min，取适量的上清液备用。然后按试剂盒说明书测定小鼠肝糖原的含量。

1.12 统计学处理

2 结果

2.1 紫皮石斛对小鼠负重游泳的影响

与空白对照组比较，人参皂苷组、紫皮石斛高剂量组能明显延长小鼠负重游泳的力竭时间，且差异有统计学意义(P<0.05，表1)。

GroupLoad swimming timeControl46.39±31.48Ginsenoside78.85±27.68*High dose76.91±34.61*Middle dose62.83±29.37Low dose66.27±37.77

*P<0.05vscontrol group

2.2 紫皮石斛对小鼠血清尿素氮和乳酸的影响

与空白对照组比较，人参皂苷组能明显降低小鼠游泳后的血清尿素氮和乳酸含量，且差异有统计学意义(P<0.01，表2)。紫皮石斛各剂量组均能明显降低小鼠游泳后的血清乳酸含量，且差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01，表2)；紫皮石斛高剂量组及低剂量组能明显降低小鼠游泳后的血清尿素氮含量，且差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01，表2)。

GroupUrea nitrogen(mmol/L)Lactic acid(mg/L)Control2.97±0.300.72±0.29Ginsenoside2.35±0.41*0.38±0.11**High dose2.38±0.43*0.42±0.25**Middle dose2.61±0.240.42±0.24**Low dose2.49±0.16**0.47±0.16*

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group

2.3 紫皮石斛对小鼠肝糖原的影响

与空白对照组比较，人参皂苷组、紫皮石斛高剂量组及中剂量组能明显增加小鼠肝糖原的储备量，且差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01，表3)。

GroupLiver glycogenControl1.07±0.09Ginsenoside1.66±0.48*High dose2.10±0.70**Middle dose1.21±0.10*Low dose1.34±0.25

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group

3 讨论

紫皮石斛在云南龙陵有大量人工栽培，且具有质量好的特点，故在2011年11月该县被中国中药协会授予“中国紫皮石斛之乡”称号，2012年“龙陵紫皮石斛”获得国家工商行政管理总局颁发的《地理标志证明商标注册》证书[2]。其在民间有广泛应用，常常将其当作蔬菜、果汁、茶品、泡酒等药食两用来食用，并受到广大民众的喜爱。但近年来随着紫皮石斛种植面积的扩大，产量大于需求，导致紫皮石斛滞销，价格低廉。为此，本实验以紫皮石斛的功效、化学成分及药理作用为理论依据，探究紫皮石斛的抗体力疲劳作用，从而提高紫皮石斛的社会价值和经济价值，为其产链的发展奠定基础。

体力疲劳是复杂的生理变化过程，它与很多因素有关，如缺氧、能源物质耗竭、代谢产物增加、免疫能力降低、内分泌紊乱等等。目前公认体力疲劳主要是由于机体能源物资耗竭及其代谢产物增加，引起内环境功能紊乱，导致工作效率降低。糖原是机体主要的能源储备物质[10]。机体长时间剧烈运动时，主要依靠肌糖原、肝糖原的分解供能。长时间运动可造成糖原大量的消耗或耗竭，引起能量供应不足, 诱发体力疲劳。因此，糖原储备量可反映运动的程度和持续时间，可作为评价体力疲劳的一个敏感指标[10-12]。当机体持续长时间运动会导致能源物质供应不足，会诱发组织中蛋白质分解来补充能量不足，蛋白质分解会使体内尿素氮生成增加，并与运动耐力成正相关。即尿素氮含量可反映运动耐力程度, 可作为评定体力疲劳的一个指标[10-12]。在剧烈运动过程中，机体组织缺氧，糖酵解加快，乳酸生成增多，肌肉组织中pH值下降，从而降低肌肉收缩能力，引起体力疲劳。因此，乳酸水平可反映机体运动程度，可作为评价体力疲劳的一个重要指标[10-12]。此外，结合《保健食品研制思路与方法》中抗疲劳功能评价的方法，通过测定小鼠负重力竭游泳时间及体内血乳酸、血清尿素氮、肝糖原的含量，可判断紫皮石斛是否具有抗体力疲劳的作用[10]。

实验结果表明，紫皮石斛能明显延长小鼠负重力竭游泳时间，增加肝糖原含量，并能降低血清乳酸、血清尿素氮含量，且具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。据《保健食品研制思路与方法》所述，凡是负重游泳实验结果阳性，血乳酸、血清尿素氮、肝糖原3项生化指标中任2项指标阳性，可判定该受试样品具有缓解疲劳的作用[13]。综上所述，紫皮石斛具有抗体力疲劳作用，主要由于紫皮石斛增加肝糖原储备，抑制糖酵解及蛋白质分解，使体内的乳酸及尿素氮生成减少，从而达到缓解体力疲劳的作用。