复方扁咽宁对急性咽炎大鼠疗效及其机制*

文德鉴， 袁丽君， 李三宇， 张翠兰， 朱敏英， 胡泽华， 涂 星△

(1. 风湿病发生与干预湖北省重点实验室， 恩施 445000； 2. 湖北民族大学医学部， 恩施 445000)

急性咽炎是一种以咽部疼痛或干燥、有灼热感或异物感，并在吞咽时加重为主要临床表现的一类常见疾病，复发率高，其发病机制主要是病毒、细菌或理化因素刺激造成的咽喉部炎症反应[1,2]。该病属于中医“急喉痹”证范畴，本质上是本虚标实，为风热循经犯肺而蕴热，上侵咽喉致气滞血壅，咽喉部出现黏膜红肿而发病，治疗上宜滋肾润肺、泻火解毒[3-5]。复方扁咽宁方主要由连翘、玄参、麦冬、金银花、野菊花、重楼等10味药组成，主要配伍，以清热解毒为主，兼具滋阴润肺、消肿止痛之功，为临床使用多年治疗急慢性咽炎、急慢性扁桃体炎发作期及缓解期的民间验方，其方药组成简单，疗效确切，复发率低，且未见明显不良反应；但其作用机制尚不明确，对患者病灶部位的影响因取材的伦理问题而无法开展研究。

本研究拟通过氨水喷咽部诱导法建立急性咽炎大鼠模型，观察复方扁咽宁治疗急性咽炎模型大鼠的疗效，考察其对损伤支气管和肺组织的形态及血清IL-1β和TNF-α的含量影响，初步探讨其治疗急性咽炎的疗效和抗炎作用机制，为该药的进一步研究开发利用奠定基础，也为该药的临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SD雄性大鼠80只，体重(200±20)g，分笼饲养，由湖北省实验动物研究中心，许可证号：SCXK(鄂)2015-0018。常规适应性饲养7 d。

1.2 药物与试剂

复方扁咽宁由玄参、桔梗、麦冬、重楼、赤芍等药物组成，药材均购自湖北民族学院附属民大医院药房；大鼠IL-1β ELISA试剂盒、大鼠TNF-α ELISA试剂盒均购于上海酶联生物科技有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.3 仪器

RE52CS-1旋转蒸发仪，上海贤德实验仪器有限公司；DL-1电子万用炉，北京市永光明医疗器械有限公司；5810R低温冷冻离心机，德国eppendorf公司；KL型自动脱水机、生物组织自动包埋机、组织切片机等均购于湖北康龙电子科技有限责任公司；JFC-1600离子溅射镀膜仪、JSM-5610扫描电镜，均购于日本JEOL公司；Plus384型连续波长酶标仪，购于美谷分子仪器(上海)有限公司。

1.4 复方扁咽宁制备

按照复方扁咽宁的处方称取各味中药，浸泡 0.5 h后，依次加8倍煎煮1.5 h，滤过，滤渣再加入6倍水，煎煮1 h后滤过，合并两次滤液后，减压浓缩至相当于生药0.576 g/ml、1.152 g/ml、2.304 g/ml，置于5℃冰箱内保存备用。

1.5 动物模型制备、分组及干预

根据文献资料[5]选取SD雄性大鼠70只，体重(200±20)g，配制浓度为15%的氨水以自制喷雾器喷洒大鼠咽部(每次残留咽部量约5～8 μl)，每次喷3下，每天两次，连续3 d后，若大鼠出现挠抓口部以及咽部出现充血、肿胀即为造模成功。选取造模成功的大鼠，随机分为模型组，复方扁咽宁高、中、低剂量组，每组10只。另取SD大鼠10只，同法喷予等量蒸馏水，作为正常对照组。造模成功后第2日，复方扁咽宁高、中、低剂量组按12.5 ml/kg分别给以浓度为2.304 g/ml 、1.152 g/ml、0.576 g/ml的药液对大鼠灌胃，即给药剂量分别为28.8 g/kg, 14.4 g/kg, 7.2 g/kg(相当于生药)，正常对照组与模型组同法灌胃等量蒸馏水，每日一次，连续7 d。

1.6 指标检测

1.6.1 一般症状观察 实验过程中每天观察和记录各组动物饮食、饮水变化、活动状态及大鼠咽部变化情况，包括黏膜形态和色泽、口腔分泌物。

1.6.2 血清中TNF-α以及IL-1β含量检测 末次给药24 h后，用10%的水合氯醛以3 ml/kg剂量麻醉大鼠后，腹主动脉取血，置于抗凝离心管中混匀， 3 000 r/min离心20 min，收集上清液，按照上海酶联生物科技有限公司ELISA试剂盒说明书在450 nm波长处检测各组大鼠血清中TNF-α以及IL-1β含量。

1.6.3 气管及肺组织病理样本的制备及观察 处死动物立即从环状软骨水平剪断气管食管，摘取气管及左肺下叶组织，在10%甲醛溶液中固定，置于4℃冰箱中保存过夜。次日取材后经常规脱水，石蜡包埋，切片，HE染色后，在光学显微镜下观察。

1.6.4 气管纤毛样本的制备及超微结构观察 在4℃操作台上取长2 cm气管生理盐水冲洗至黏膜表面粘液消失，以2.5%戊二醛固定液固定2 h，用0.2 mol/L二甲胂酸钠缓冲液浸洗3次，每次15 min。再用1%锇酸固定2 h，用0.2 mol/L二甲胂酸钠缓冲液浸洗3次，每次15 min。常规梯度脱水，临界干燥0.5 h后以离子溅射喷金，采用扫描电镜观察。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 一般症状观察结果

造模3 d后模型组大鼠出现挠抓口部，观察大鼠咽部，出现充血、肿胀，饮水增多，食量下降，自发性活动减少等现象，而正常组大鼠咽部黏膜形态正常、颜色淡红，未见明显异常分泌物，正常饮水、饮食以及活动；给药2 d后，复方扁咽宁高、中、低剂量组大鼠咽部红肿及动物搔抓情况出现不同程度的减轻，且高、中剂量组疗效优于低剂量组，6 d后基本痊愈；而模型组大鼠在5 d左右症状有轻微改善。研究结果表明复方扁咽宁高、中剂量可加快急性咽炎的恢复进程。

2.2 血清中TNF-α以及IL-1β含量测定结果

与正常组相比，模型组、低、中、高剂量组血清中TNF-α及IL-1β含量显著升高(P<0.05)，提示本实验氨水诱导的急性咽炎模型大鼠出现了炎性介质的分泌，出现了呼吸道的炎症感染；与模型组相比，复方扁咽宁低、中、高剂量组血清中TNF-α及IL-1β含量显著降低(P<0.05)，且中、高剂量组血清中TNF-α及IL-1β含量差异不具有统计学意义(P>0.05，表1)，提示高剂量和中剂量复方扁咽宁加速急性咽炎康复的作用可能与降低血清中TNF-α及IL-1β的释放有关。

Group TNF-α IL-1βControl group28.3429±2.754549.8086±5.5965Model group56.0467±5.9373*98.8217±8.9509*Low dose group50.2033±3.0434*#84.9700±6.1702*#Middle dose group41.7817±3.1716*#▲59.7317±4.3938*#▲High dose group40.4400±2.7818*#▲63.5817±6.6979*#▲

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group;

▲P<0.05vslow dose group

2.3 气管及肺组织病理样本观察结果

对肺组织形态的观察结果见图1。由图1可见，正常组肺组织结构完整，肺间质无明显增生，肺泡腔清晰，肺泡间隔均匀一致，未见言行细胞浸润(图1A)；模型组肺泡间隔出现明显增宽，肺泡壁断裂融合，部分肺泡腔出现萎缩陷，其内充满淡红色水肿液，肺泡间隔内见大量多形核中性白细胞和肺泡巨噬细胞浸润，毛细血管充血、扩张、出血，血管周围可见水肿液形成水肿套(图1B)；低剂量组泡出现明显增宽或萎缩，肺泡壁断裂融合，部分肺泡腔出现萎缩陷，肺泡间隔内可见大量中性白细胞和肺泡巨噬细胞浸润，毛细管的充血现象较明显，血管周围可见水肿液形成水肿套(图1C)；中剂量组肺泡腔结构较为清晰完整，肺泡间隔内中性白细胞和肺泡巨噬细胞浸润有改善，未见明显毛细管充血、扩张和出血，血管周围水肿液形成水肿套数量明显减少(图1D)；高剂量组肺泡腔结构较为清晰完整，偶见中性白细胞和肺泡巨噬细胞浸润，未见明显毛细管充血、扩张和出血，偶见血管周围水肿液形成水肿套(图1E)。

Fig.1HE results of lung tissues (×400)

A: Normal group; B: Model group; C: Low dosage group; D: Middle dosage group; E: High dosage group

对肺支气管的形态观察结果见图2。由图2可见，正常组支气管上皮细胞结构完整、排列整齐，管腔内未见炎症细胞、红细胞及纤维蛋白等渗出物，肺泡间隔清晰、未见毛细血管扩张、充血现象，肺泡结构完整(图2A)；模型组支气管上皮细胞排列极其紊乱，表面有大量粘液，杯状细胞增生明显，肺间质毛细血管扩张充血，大量炎症细胞浸润，支气管腔增宽，其内含出大量红细胞、炎症细胞、纤维蛋白和水肿液，肺泡结构破坏，空肺泡数量明显减少，肺实质增多(图2B)；低剂量组支气管腔上皮细胞损伤较轻，少量上皮细胞排列紊乱，腔内可见炎症细胞、红细胞及渗出液，部分肺泡间隔增宽，毛细血管扩张充血，肺实质稍增多，空肺泡有所减少(图2C)；中剂量组支气管腔上皮细胞排列较完整，偶见上皮细胞排列紊乱，腔内炎症细胞、红细胞及渗出液减少，偶见肺泡间隔增宽，偶见毛细血管扩张充血，肺实质稍增多，空肺泡有所减少(图2D)；高剂量组支气管腔上皮细胞排列较完整，偶见上皮细胞排列紊乱，尚未坏死脱落的纤毛排列恢复正常，支气管腔内坏死脱落物、炎症细胞基本吸收，有少量渗出液，肺泡间隔毛细血管未见明显扩张充血，肺实质逐渐减少，偶见空肺泡(图2E)。

Fig.2HE results of bronchus tissues in lung(×200)

A: Normal group; B: Model group; C: Low dosage group; D: Middle dosage group; E: High dosage group

2.4 气管纤毛样本超微结构观察结果

结果见图3。正常组气管纤毛结构正常，排列整齐，浓密(图3A)；模型组纤毛排列紊乱，出现大量纤毛倒伏、水肿、融合、变粗，甚至呈“蚯蚓”状，偶见纤毛脱落、坏死，多数杯状细胞表面粘液增多、轮廓模糊，微绒毛结构较模糊(图3B)；低剂量组纤毛排列较紊乱，出现纤毛倒伏、水肿、融合、变粗，甚至呈“蚯蚓”状，部分杯状细胞表面粘液增多、轮廓模糊，微绒毛轮廓较清晰，有轻微粘连(图3C)；中剂量组纤毛受损程度较轻，可见纤毛排列较整齐，少量纤毛倒伏，偶见聚集和融合现象，未见水肿和渗出，纤毛形态基本正常，少量杯状细胞表面粘液增加，微绒毛形态正常、清晰可见(图3D)；高剂量组纤毛形态基本正常，排列较整齐、致密，偶见纤毛倒伏，杯状细胞轮廓清晰，偶见少量粘液附着于其表面(图3E)。

Fig.3SEM graphs of trachea cilia (×2 000)

A: Normal group; B: Model group; C: Low dosage group; D: Middle dosage group; E: High dosage group

3 讨论

现代医学研究表明流感病毒、副流感病毒、柯萨奇病毒、腺病毒、鼻病毒、葡萄球菌、甲型链球菌、肺炎双球菌等病毒和细菌感染或高温、粉尘、烟雾等物理或化学因素刺激等均是引起急性咽炎的诱因[2,6-10]。复制或建立成功的急性咽炎动物模型是研究治疗咽炎及上呼吸道炎症感染的药物疗效和作用机制的前提保证，但目前国外报道较少。国内目前较常用的模型主要包括氨水直接喷雾法、氨水定点定量涂抹法、细菌注射感染法等[11-15]，考虑到细菌注射感染法制作模型相对较困难，氨水定点定量涂抹法模型维持时间较短，均不利于开展中药复方制剂的药理学研究，故本研究采用了氨水直接喷雾法复制急性咽炎模型，所建立的模型出现了粘液分泌增多、咽部黏膜充血、肿胀等与急性咽炎临床表现相似度较高，表明本模型较为成功；但同时本研究所建立的模型出现了一定程度的口腔灼伤和肺部损伤，提示该模型可能也可以作为口腔溃疡和慢性咽炎动物模型，与文献报道一致[16]。

复方扁咽宁由玄参、桔梗、麦冬、重楼等组成，以苦寒之药为主，配伍甘寒之品，佐以少量辛温之药，重在清热解毒，清肺胃之热且兼顾滋阴.本研究结果显示，复方扁咽宁可明显改善急性咽炎模型大鼠的一般状态，缓解急性咽炎模型大鼠支气管及肺组织炎症反应，加速急性咽炎的康复过程。

TNF-α是急性炎症相关重要的炎症指标，是由活性T细胞和巨噬细胞产生，能活化内皮细胞、嗜中性白细胞及巨噬细胞，刺激淋巴细胞增殖和分化，促进炎症细胞聚集、活化和炎症介质的释放，加重炎症症状。IL-1β是重要的促炎因子，与TNF-α的释放相互促进，在急性肺组织损伤中，TNF-α起着始动作用，IL-1β具有协同作用[17,18]。本研究结果显示，复方扁咽宁可显著降低炎症大鼠血清中 IL-1β和 TNF-α的含量，改善支气管及肺的组织形态。综上，本研究从药效学上验证了复方扁咽宁对氨水诱导的急性咽炎模型大鼠具有良好的治疗作用，其作用机制可能与抑制血清IL-1β和TNF-α的释放等有关。