单增李斯特菌恒温荧光PCR检测方法的建立及应用

贾培 盛司潼 兰全学

摘 要：以单增李斯特菌的clfA基因为靶序列，针对该序列保守区，设计引物和探针，建立单增李斯特菌荧光PRA检测方法，研制单增李斯特菌荧光PCR快速检测试剂盒，并对其特异性、灵敏性、稳定性进行分析。结果表明该恒温荧光PCR方法及快速检测试剂盒特异性好、稳定性好、具有较高的灵敏度，最低可检测到0.05 pg/μL，是快速检测食源性增李斯特菌的有效方法，对我国食源性增李斯特菌的检测具有重要应用和推广价值。

关键词：单增李斯特菌；恒温荧光PCR；试剂盒

中图分类号：R155 文献标志码：A

单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）（以下简称单增李斯特菌）属于革兰氏阳性菌，是最常见的人畜共患型食源性致病菌之一，能够引起较严重的人畜共患病，象肠胃炎、脑膜炎、败血症等疾病，孕妇、婴幼儿、老年人及免疫力低下者更易感染。单增李斯特菌广泛存在于各类乳制品、蔬菜、肉类等食品中，具有极强的生命力，其能够在-4 ℃～45 ℃，pH值为4～9，甚至高盐（14 %及以上）等恶劣环境条件下生存。对人的健康构成了极大威胁。食品中单增李斯特菌的检测技术则成为食源性疾病预防与控制的关键。因此，开发一种高效、灵敏的快速检测单增李斯特菌的方法及试剂盒迫在眉睫。

该研究拟根据单增李斯特菌的clfA基因的保守序列，设计RPA检测所需的引物及探针，建立一种能够快速检测单增李斯特菌的简便、高效、特异、灵敏、适于现场快速检测的技术方法，研制出单增李斯特氏菌核酸检测试剂盒（RPA—荧光法）对单增李斯特菌扩增结果进行检测，并对其特异性、灵敏度、稳定性进行测试。

1 材料与方法

1.1 试剂与耗材

实验所用的标准菌株—单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）（菌株编号ATCC 19115）由广东环凯微生物科技有限公司代买；细菌DNA提取试剂盒，宝生物工程有限公司；RPA扩增试剂盒，TwistDX公司；Premix预混合液，宝生物工程有限公司；引物和探针由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 主要仪器

恒温金属浴，HYK公司；qPCR仪，ABI；PCR仪，Labnet；Flurometer，ABI；NanoDrop，Thermo等。

1.3 引物、探针的设计与合成

拟利用NCBI数据库对目前相关分子生物学检测单增李斯特菌的常用靶基因进行BLAST分析，进行数据的比对分析，从中查询适用于RPA检测的靶序列，以此来设计引物及探针（见表1），所扩增的基因序列作为检测单增李斯特菌的靶基因。

1.4 模板DNA的制备

将单增李斯特菌在37 ℃条件下震荡过夜培养，按照宝生物工程有限公司细菌基因组DNA提取试剂盒的操作说明提取DNA，分为菌体裂解，DNA与膜结合，DNA纯化等过程，取上清液作为检测模板，在-20 ℃的条件下保存备用。

1.5 反应体系和反应程序的建立

将单增李斯特菌培养后，提取DNA模板，进行荧光PCR扩增。反应体系为50 μL：包括测试buffer 45.5 μL（水化buffer 29.5 μL，去离子水11.2 μL，探针0.6 μL，上下游引物各为2.1 μL）、DNA模板2.0 μL、Mg2+2.5 μL。反应时间20 min，反应温度为37 ℃，30 s/循环，30个循环，荧光收集信号。

1.6 特异性分析

制备菌株DNA样品，使用96孔板，按以下方式均匀混合制备待测样品并进行排版，见表2，反应体系和程序参考1.5。

1.7 灵敏度分析

取1 mL菌株培养液，提取DNA（浓度为5.34 ng/uL），以此为模板，用水分别稀释10倍、100倍、1 000倍、10 000倍、100 000倍等5个梯度；取3管凍干粉，加入136.5 μL测试buffer，每管平分22.75 μL，再加入1 μL稀释模板和阴性对照样品，1.25 μL醋酸镁溶液，测试5个模板梯度和一个阴性对照。

1.8 稳定性测试

通过加速实验确定试剂盒的稳定性，设计3个保存温度，分别为25 ℃、35 ℃、45 ℃，放置天数分别为2天、8天、14天、17天；每个条件取配置700 μL测试buffer，每个温度条件每个时间节点取45.5 μL buffer和1管冻干粉（作为一个独立包装）；将每个包装的冻干粉用对应的buffer溶解，然后配制成2个25 μL的反应体系（参照1.5），由于样品较多，采用冰上加样方式，确保反应同时开始；）测试采用试剂盒提取的基因组DNA样本，对应的样品浓度为单增李斯特菌18.3 pg/μL。

2 结果与分析

2.1 单增李斯特氏菌核酸检测试剂盒（RPA—荧光法）的特异性

利用所建立的恒温荧光PCR检测试剂盒检测单增李斯特菌，结果如图1所示，待测阳性样品均有扩增曲线，空白对照的扩增曲线呈阴性，从而说明荧光PCR检测试剂盒的单增李斯特菌特异性良好，能够有效地将单增李斯特菌从其他菌中区分出来。

2.2 单增李斯特氏菌核酸检测试剂盒（RPA—荧光法）的灵敏度

利用荧光PCR方法开发的快速检测试剂盒分别对不同浓度的模板进行检测，如图2所示，空白对照试验无扩增曲线，证明测试结果有效，最低检测限对应样品浓度为单增李斯特菌0.05 pg/?L。从而表明荧光RPA快速检测试剂盒检测单增李斯特菌的灵敏度可以达到0.05 pg/μL。

2.3 单增李斯特氏菌核酸检测试剂盒（RPA—荧光法）的稳定性测试

单增李斯特氏菌核酸检测试剂盒在3种不同温度条件下显示（见表3），温度每升高10 ℃，反应速率就会增加2～4倍，反之温度每降低10 ℃，反应速率就会降低2～4倍，按照降低2倍的参数计算，从-20℃～25 ℃，温度降低了4.5个10 ℃，反应速率降低22倍，25 ℃下放置17天的变化等同于-20 ℃放置374天。对数据进行低温折算（见表4），发现均在180天以上，据此试剂盒的有效期至少可判定为：-20 ℃保存6个月。

以偏差在20%以內的变化作为接受标准，统计不同试剂盒在不同温度下的最长保存天数。

2.4 讨论

单增李斯特菌是引起食源性疾病的常见致病菌，该研究所开发的荧光RPA方法及检测试剂盒可以快速高效地检测单增李斯特菌。相比于目前的传统培养方法、荧光PCR方法，恒温荧光PCR方法检测时间短，在20 min内就可以得到检测结果；通过灵敏度实验发现，该方法特异性好，稳定性好，对于单增李斯特菌的检测灵敏度可以达到0.05 pg/μL。 此外，传统培养方法的检测过程烦琐，荧光PCR方法的检测过程包括预变性、变性、退火、延伸等步骤，且每个过程都需要不同温度，这就迫使荧光PCR方法需要温度调节装置，设备费用高，而荧光RPA方法是一种等温扩增程序，且反应温度在35 ℃～42 ℃，不需要复杂的温度控制装置。因此开发荧光RPA方法及快速检测试剂盒检测单增李斯特菌具有重要的实际意义。

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