三种检测猪瘟疫苗中牛血清蛋白含量的ELISA试剂盒的性能对比

曹玉美，方茜，陆江，孙如水，孙龙

（广西农垦永新畜牧集团有限公司良圻原种猪场，广西 横县 530317）

当前疫苗生产中普遍采用牛血清作为细胞培养的主要成分，这导致疫苗中不同程度地残留有牛血清蛋白，牛血清残余蛋白对于机体来说是一种异源蛋白，如果残留种类多，注射疫苗后就可能引起过敏性休克等不良反应[1]。目前已见报道的过敏成分主要是牛血清白蛋白（BSA）和牛血清IgG（B-IgG）。为了有效控制过敏原含量，《中国生物制品规程（2000年版）》明确规定疫苗中牛血清蛋白的残余量不得超过50ng/mL[2]。由于疫苗质量的安全性越来越受到关注，因此，建立检测疫苗中牛血清蛋白残留量的方法和研制相关试剂盒具有十分重要的意义。早在2004年国内已经研制出能定量检测牛血清蛋白含量的酶联免疫试剂盒，市面上也出现了许多厂家研制的检测牛血清蛋白含量的ELISA试剂盒，而众多试剂盒的检测效果存在差异，选择一款稳定性好、灵敏度高的试剂盒成为有效控制牛血清蛋白含量的关键。本试验从市面上选购了3种用于检测猪瘟疫苗中牛血清蛋白含量的ELISA试剂盒（分别为A、B、C），由本实验室人员对这3种试剂盒进行各项质量参数验证，并分别用其对18个猪瘟疫苗样品进行牛血清蛋白含量检测，以此评价这3种试剂盒用于常规疫苗质量控制的可行性。

1 材料

1.1 检测仪器及试剂 酶标仪；ELISA试剂盒A（生产批号：201708），其检测范围为 1～45ng/mL；ELISA试剂盒B（生产批号：2017082809），其检测范围为1～45 ng/mL；ELISA 试剂盒 C（生产批号：201708），其检测范围为0.5～80ng/mL。所有试剂盒均在保质期内使用。

1.2 待检样品 选择18个猪瘟疫苗作为待检样品。

2 方法

2.1 标准曲线绘制 准确按照试剂盒的操作说明进行标准曲线绘制，通过对比3种试剂盒标准曲线线性方程的相关性及变异系数来验证试剂盒的稳定性。具体操作步骤如下：

2.1.1 标准品稀释 准备5支稀释标准品的EP管，每支EP管加入150μL标准品稀释液，将试剂盒中的标准品原液进行倍比稀释，得到5个不同浓度的标准品，试剂盒A的标准曲线浓度分别为2.5、5、10、20、40ng/mL，试剂盒B的标准曲线浓度分别为2.5、5、10、20、40ng/mL，试剂盒 C 的标准曲线浓度分别为5、10、20、40、80ng/mL。

2.1.2 加样 将稀释好的标准品加入酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动均匀，并设置空白孔（不加样品及酶标试剂，其余各步骤操作相同）。

2.1.3 温育 用封口膜封板后置37℃恒温箱中温育30min。

2.1.4 配液 将浓缩洗涤液用蒸馏水稀释30倍后使用。

2.1.5 洗涤 小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去。如此重复5次，拍干。

2.1.6 加酶 每孔加入酶标试剂50 μL，空白孔除外。

2.1.7 温育、洗涤 操作同上。

2.1.8 显色 每孔加入显色剂A 50μL，再加入显色剂B 50μL，轻轻振荡混匀，37℃避光显色10min。

2.1.9 终止 每孔加入终止液50μL，终止反应。

2.1.10 测定 以空白孔调零，450nm波长读取各孔吸光度值。

2.2 猪瘟疫苗样品检测 准确按照试剂盒的操作说明对本场的18个猪瘟疫苗样品进行牛血清蛋白含量测定，每个样品做两个重复，取平均值。具体操作同2.1步骤，只是在加样时先加入40 μL样品稀释液，再加入10 μL待测样品，最终将样品稀释5倍，其余步骤均相同。通过标准曲线回归线性方程和样品吸光度，测得样品中牛血清蛋白的含量，并对其变异系数进行对比，比较检测结果的差异及符合程度。

3 结果

3.1 标准曲线 3种试剂盒的标准曲线及其相关系数详见表1。试剂盒A的标准曲线为y=0.079 1x+0.4997，相关系数为0.9692；试剂盒B的标准曲线为y=0.0350x-0.0089，相关系数为0.9948；试剂盒C的标准曲线为y=0.0045x+0.0787，相关系数为0.9884。可见试剂盒B的标准曲线的相关性较高。

表1 3种试剂盒的标准曲线及其相关系数

3种试剂盒标准品吸光度值的变异系数详见图1。由图可知，试剂盒A的变异系数在0.005～0.115之间，试剂盒B的变异系数在0.005～0.439之间，试剂盒C的变异系数在0.104～0.260之间。可见试剂盒A标准曲线的变异系数最小。

图1 3种试剂盒标准品吸光度值的变异系数

3.2 猪瘟疫苗样品中牛血清蛋白含量的测定 3种试剂盒对18个猪瘟疫苗样品检测所得到的结果详见表2。使用试剂盒A检测时，样品浓度均为负值，说明样品中未检出牛血清蛋白。使用试剂盒B对相同样品进行检测时，结果发现样品中牛血清蛋白的含量在36.99～57.27ng/mL之间，而试剂盒B的检测范围为1～45ng/mL，其中有10个样品浓度超出了检测范围，并且有7个样品的牛血清蛋白含量超标（＞50ng/mL）。由于含量超过试剂盒检测范围，试剂盒B的检测结果有待考证，需要对样品稀释后进行再次检查。使用试剂盒C检测样品时，发现样品中牛血清蛋白的含量在28.07～39.96ng/mL之间，其含量均在试剂盒检测范围内，且低于生物制品规程中的相关规定。

表2 3种试剂盒检测疫苗样品中的牛血清蛋白含量 ng/mL

图2 3种试剂盒检测样品时的变异系数

3种试剂盒在检测18个猪瘟疫苗样品时吸光度值的变异系数详见图2。由图可知，试剂盒A的变异系数在0.002～0.186之间，试剂盒B的变异系数在0.003～0.124之间，试剂盒 C的变异系数均小于0.063。可见用3种试剂盒检测样品时，试剂盒C的变异系数最小。

4 讨论

酶联免疫吸附法是一种与国际接轨的检测方法，主要通过制作标准曲线来确定相关系数，再通过直线范围内的吸光度值来计算出样品中的牛血清蛋白含量，可以对样品进行定量测定，并且具有特异性好、灵敏度佳的优点[3]。早在2004年，国内就已经研制出了用于检测牛血清蛋白的ELISA试剂盒，经过验证，具有较好的准确度、灵敏度和可重复性，且操作快捷。本试验对3个不同生产厂家的ELISA试剂盒进行了各项质量参数验证，对比其用于常规疫苗质量控制的可行性。

通过绘制标准曲线，可以看到3种试剂盒的相关系数均在0.95以上，相关系数最好的是试剂盒B，其次为试剂盒C，试剂盒A最差。但从标准曲线的变异系数来看，试剂盒A与试剂盒C的变异系数趋势较一致，波动较小，特别是试剂盒A的变异系数均在0.115以内；而试剂盒B的变异系数波动较大（有两个点的变异系数高于0.35），说明其标准曲线离散度大于其他两种试剂盒。

在使用3种试剂盒检测疫苗样品中的牛血清蛋白含量时，试剂盒A的结果均为负值，说明未检出，而试剂盒B与试剂盒C的结果均显示样品中含有不同浓度的牛血清蛋白，且试剂盒B的检测结果显示有7份样品的牛血清蛋白含量高于50ng/mL，超标率为38.88%，而试剂盒C的结果显示18个样品的牛血清蛋白含量均在规定范围内。从检测样品的变异系数来看，试剂盒A的变异系数较大，波动幅度大于其他两种试剂盒，而试剂盒B与试剂盒C有较一致的变异趋势，且试剂盒C的变异系数最小。说明在检测样品时，试剂盒C的重复性优于其他两种试剂盒。

5 结论

整体而言，试剂盒C表现出较好的稳定性和可操作性，具有较好的相关性及可重复性。由于3种试剂盒所测样品的牛血清蛋白含量的差异较大，无法最终判断疫苗样品中牛血清蛋白的含量，故建议使用已知浓度的牛血清蛋白标准品进行再次检测，以确定试剂盒检测结果的准确性；也可以在检测时，适当将疫苗样品稀释，然后进一步检测。综上所述，3种试剂盒的优劣各有千秋，还需要进一步的试验验证。