黄花败酱总皂苷的HPLC-Q-TOF MS成分分析

陈淑玲，王晓玉，钟艳梅，李卫东，4，韩亮，4

(广东药科大学 1.中药学院; 2.健康学院; 3.中心实验室，广东 广州 510006； 4.广东省光与健康工程技术研究中心，广东广州 510310)

黄花败酱为败酱科(Valerianaceae)败酱属(Patrinia)黄花败酱(PatriniascabiosaefoliaFisch)的根或带根全草，在我国分布广泛[1]，味辛、性寒，始载于《神农本草经》，具有清热利湿、解毒排脓、祛瘀止痛的功效[2]。现代药理研究表明，黄花败酱具有抗菌[3]、抗病毒、抗感染、保肝利胆、抗肿瘤和抗氧化等作用[4-5]，临床上常用于治疗溃疡性结肠炎、阑尾炎和慢性胃炎等[6]。据文献报道，黄花败酱醇提物对溃疡性结肠炎具有显著的改善和治疗作用[7]；本课题组前期研究结果也显示，黄花败酱总皂苷提取物对三硝基苯磺酸致大鼠溃疡性结肠炎具有明显的改善和治疗作用，不仅能显著降低炎症结肠组织的TNF-α、IL-1β含量、MPO活性和MDA水平，而且能明显升高SOD活性[8-9]；从黄花败酱根部分离得到的皂苷类化合物能够提高血清转氨酶的活性，抑制肝炎病毒的活性，其苷元齐墩果酸更被认为是抗肝炎的强活性成分[10]：因此，推测黄花败酱皂苷类成分可能为其抗感染主要药效活性成分。

目前，黄花败酱的药效物质基础尚不明确[11-12]，对黄花败酱皂苷类成分的研究报道尚少，为了进一步揭示黄花败酱药效物质基础，开发其药用价值，本研究采用高效快速、高灵敏度的HPLC-Q-TOF MS方法对黄花败酱总皂苷部位的化学成分进行了鉴别分析，为黄花败酱的进一步开发和利用奠定理论基础。

1 仪器与材料

黄花败酱(500 g)，购自广州至信药业股份有限公司，批号为：170701，经广东药科大学中药学院王凤云老师鉴定为黄花败酱(PatriniascabioscaefoliaFisch)的带根全草。黄花败酱总皂苷部位(由本课题组前期研究所得的最佳提取纯化工艺所制得)。黄花败酱皂苷C(Scabioside C)对照品(质量分数98.49%，成都曼思特生物科技有限公司，批号：MUST-17103006)；齐墩果酸对照品(质量分数≧98%，成都普菲德生物技术有限公司，批号：121213)；乙腈(色谱纯，德国Merk公司)；甲酸(色谱级，德国Merk公司)；甲酸铵(色谱级，美国aladdin公司)。

HPLC-Q-TOF MS联用仪(美国安捷伦公司)，色谱柱：ACQUITY UPLCTM BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)。

2 方法

2.1 供试品溶液的制备

称量黄花败酱总皂苷30 mg于2 mL EP管中，加70%(体积分数，下同)甲醇溶解并超声10 min，12 000 r/min高速离心，取上清液，即得。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取黄花败酱C对照品0.1 mg，加70%甲醇水溶液1 mL，得对照品溶液。

2.3 色谱及质谱条件

色谱条件：色谱柱为ACQYITY UPLCTM BEH C18(1.7 μm，2.1 mm×50 mm)；柱温为35 ℃；进样量为3 μL；流速为0.3 mL/min；波长为330 nm；以0.1%甲酸-10 mmol/甲酸铵为流动相A，乙腈为流动相B，梯度洗脱(0～4 min，98%～85%A；4～9 min，85%～80%A；9～11 min，80%～78%A；11～15 min，78%～50%A；15～18 min，50%～30%A；18～22 min，30%～10%A；22～25 min，10%～0%A；25～30 min，100%B)。

质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，正离子采集模式，毛细管电压为3 500 V，锥孔电压为35 V，干燥气流速为8 L/min，干燥气温度为320 ℃，扫描范围(m/z)为100～1 500，MS/MS二级扫描碰撞能为20 V。

2.4 数据分析

采用Qualitative Analysis B.0 7.00软件分析各化学成分的保留时间及其质谱信息，并结合分子离子峰与对照品、文献报道的数据进行对比，再通过与Scifinder、Massbank和Chemspider等数据库进行峰匹配检索，对其中的化学成分进行有效辨别。

3 结果

对黄花败酱总皂苷部位进行了正离子一级全扫描(50～1 500)及二级质谱扫描，色谱扫描检测时间为30 min，色谱峰分离较好，如图1所示。对其中的27个峰进行了分析鉴定，结果见表1。

本研究对27个色谱峰进行了识别鉴定，主要通过分析各色谱峰的一级和二级质谱图，获取各个成分的高分辨质谱分子量及分子式信息，通过Science finder、Massbank、Chemspder等数据库的检索并结合有关文献的比对，最终鉴定了以下化学成分(见表1)。以下以峰24为例说明分析过程。

数据处理采用Qualitative Analysis B.07.00分析软件，从图2可见，峰24的分子离子峰为m/z767.439 9[M+H]+，由高分辨质谱给出其元素组成(预测分子式)为C41H66O13。从图3可看到，在二级质谱中出现了m/z605、587、456、455及437等特征碎片离子，推测m/z605 [M+H-glc]+由[M+H]+脱去一分子葡萄糖形成，m/z587[M+H-glc-H2O]+由[M+H]+脱去一分子葡萄糖和水形成，m/z456[M+H-glc-ara]+由[M+H]+脱去一分子葡萄糖和一分子阿拉伯糖形成，m/z455由m/z456 [M+H-glc-ara]+脱去一个H形成，m/z437在m/z455基础上再脱去一个H2O形成，推测峰24化合物可能的裂解途径如图4所示。通过查找Science finder、Massbank、Chemspder等数据库检索以及文献和标准品信息对比，峰24分子量、分子式及其质谱裂解行为与文献[13]报道和标准品黄花败酱皂苷C一致，故推断峰24所对应的化合物为黄花败酱皂苷C。

图1 黄花败酱总皂苷部位在正离子模式下的总离子流图Figure 1 Total ion current diagram of the total sapo-nins of Patrinia scabiosaefolia Fisch in posi-tive ion mode

图2 峰24的ESI-MS图谱Figure 2 The ESI-MS spectrum of peak 24

图3 峰24的ESI-MS/MS图谱Figure 3 The ESI-MS/MS spectrum of peak 24

注：glc代表葡萄糖，ara代表阿拉伯糖。

图4黄花败酱皂苷C(峰24)可能的裂解途径

Figure4Possible cleavage pathway of Scabioside C (peak 24) (Note:glc stands for glucose and ara stands for arabinose)

同理，通过与数据库、对照品和文献数据比较，识别鉴定出了其余26个峰，初步鉴定出了每个峰所对应的化合物，其中三萜皂苷类成分10种[14]，甾体皂苷2种，甾醇类3种，单萜类4种，有机酸类2种，糖苷类2种，黄酮类1种，其他类3种，其中4个化合物(芸苔甾醇-D-葡萄糖苷、孕烷，β-D-核糖-己吡喃糖苷衍生物，Astraeusin C、孕烷，β-D-吡喃葡萄糖醛酸衍生物)为黄花败酱成分分析的首次报道，化合物鉴定结果见表1。

表1 黄花败酱总皂苷的化学成分分析Table 1 Chemical composition analysis of total saponins of Patrinia scabiosaefolia Fisch

4 讨论

本研究所使用的黄花败酱总皂苷部位由本课题组前期研究所优化过的总皂苷提取纯化工艺所制得，故所含的皂苷类含量较高，适用于本研究的分析。本研究采用HPLC-Q-TOF MS联用技术，快速、全面地识别了黄花败酱总皂苷部位中的主要化学成分。釆用正离子模式进行全扫描检测，发现总皂苷纯化部位成分在正离子模式下峰信息量大，质谱响应较强，可能与其中的皂苷类含量较高有关。通过高分辨质谱信息，共分离和初步鉴定出了黄花败酱大孔树脂纯化部位中的27种化合物：三萜皂苷类成分10种，甾体皂苷2种，甾醇类3种，单萜类4种，有机酸类2种，糖苷类2种，黄酮类1种，其他类3种，当中的4个化合物(芸苔甾醇-D-葡萄糖苷、孕烷，β-D-核糖-己吡喃糖苷衍生物，Astraeusin C、孕烷，β-D-吡喃葡萄糖醛酸衍生物)为黄花败酱成分分析的首次报道。目前，关于黄花败酱药效物质基础的报道不多，本研究也为黄花败酱的定性分析及进一步阐明其药效物质基础及质量控制提供有力的理论支撑和可借鉴的方法。