基于脂质体反应器的酶纳米生物传感器在敌敌畏快速检测中的应用

关桦楠，韩博林，龚德状，阎秀峰*

（1.东北林业大学 盐碱地生物资源环境研究中心，黑龙江 哈尔滨 150040；2.哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江 哈尔滨 150076）

目前，常规的农药残留检测及鉴定方法多依赖于色谱及色谱-质谱联用技术，如高效液相色谱技术、气相色谱技术、液相色谱-串联质谱技术和气相色谱-串联质谱技术等[1-4]。此类技术大多需要依托于大型实验室，且具有设备成本较高和样品前处理技术复杂等缺陷[5-6]。近年来，生物传感器技术被广泛的应用于食品、药品和环境中有害成分分析检测的相关领域，主要包括光化学生物传感器和电化学生物传感器。光化学生物传感器中荧光传感器、比色传感器和表面等离子体共振传感器因其操作简单且不受极限环境条件限制而被广泛应用于现场快速检测[5-8]。相比于光化学生物传感器，基于酶催化反应的电化学生物传感器以其成本低、高灵敏度和高特异性的优势，已逐渐成为该领域的研究热点[9-13]。针对有机磷和氨基甲酸酯类农药的检测，多以乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase，AChE）为核心元件构建电化学酶生物传感器[14-16]。AChE能够特异性的催化底物乙酰胆碱生成胆碱和乙酸，在催化反应的过程中会引起电子的迁移，可通过电化学分析方法进行定量；然而，有机磷和氨基甲酸酯类农药可特异性抑制AChE的生物活性产生酶抑制反应，进而阻碍催化反应的进行，可通过捕捉反应产物胆碱的氧化峰电流值的衰减来间接定量体系中的农药残留浓度[17-19]。尽管AChE生物传感器具有诸多优势，但是因其酶稳定性差和电信号传递困难等问题，使得该类型传感器只能用于大量样品的初筛[20-22]。

为克服常见胆碱酯酶生物传感器酶活性差和精确度低的缺陷，本研究首先采用脂质体包覆技术，构建酶抑制反应的密闭乙酰胆碱酯酶反应容器（AChE liposomes bioreactor，ALB），从而有效隔绝外界环境刺激对酶催化反应的影响；利用穿孔蛋白（Porin）在脂质体外层的磷脂层上进行随机打孔，构造出反应物进出“密闭容器”的孔道，保证电信号的有效传递。此外，选用具有良好生物相容性的半导体材料-纳米二氧化硅（SiO2）作为固载ALB的基底材料，以带有正电荷的壳聚糖（chitosan，CS）作为介质修饰工作电极；可在满足酶反应器有效负载量的基础上，极大程度地改善电子的传递速率，进而有效提升此类电化学酶传感器的灵敏度。该方法可为食品及环境中农药残留检测技术的改良和实际应用提供一种新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

AChE（Type C3389，1 000 U/mg）、Porin、氯化硫代乙酰胆碱（ATChCl）、氢化大豆卵磷脂（带负电荷） 美国Sigma-Aldrich公司；CS（脱乙酰度85%）、硅酸钠、十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）、铁氰化钾国药集团化学试剂有限公司；胆固醇、荧光黄染料德国Merck公司；敌敌畏、吡虫啉、乙草胺、溴氰菊酯和氟铃脲标准品 北京恒信生物技术公司；实验中所用试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

1.3 方法

1.3.1 ALB的制备

精确称取处方量卵磷脂、胆固醇、AChE溶液、荧光黄标记液以及吐温20共同溶于10 mL的二氯甲烷中，所得溶液置于茄形瓶中，于旋转蒸发仪37 ℃减压蒸馏，烧瓶转速200 r/min。待烧瓶中二氯甲烷去除干净且在烧瓶壁上形成均匀透明的薄膜后，加入5%的葡萄糖溶液5 mL，继续旋转30 min，使薄膜溶胀水和完全。悬浮液过滤去杂质，将滤液置于液氮当中1 min，待冷冻完全后迅速放入37 ℃的水浴锅内，待完全融化后再次放入液氮中冷冻，如此冻融一定数量的循环次数。冻融结束后，室温驯化10 min，于4 ℃保存待用。

用鱼精蛋白沉淀法分离游离的AChE和ALB。精确吸取0.1 mL脂质体悬浮液，加入10 mg/mL的鱼精蛋白液0.1 mL，旋涡振荡混合均匀，静置5 min，加入甲醇溶液1 mL混匀，溶胀20 min后，1 000 r/min离心5 min，去上清液。测定脂质体中AChE的含量和活性[8]。

1.3.2 纳米二氧化硅的制备

25 ℃条件下，向20 mL硅酸钠溶液（1 mol/L）中加入0.1 g CTAB，再加入10 mL的无水乙醇，充分混匀后调节pH值范围为4.5～5.5。伴随超声波振荡辅助（20 kHz），25 ℃反应1 h。离心去上清液，将固形物真空干燥，并用马弗炉煅烧，充分研磨后，加入去离子水，超声波振荡分散，获得纳米二氧化硅悬浮液（工作液质量浓度50 mg/mL）。

1.3.3 GCE-(ALB/SiO2)n的构建

电化学数据测定采用CHI660e型电化学工作站三电极系统完成。其中，铂电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，玻碳电极（glassy carbon electrode，GCE）为工作电极。采用金相砂纸抛光GCE，随即在去离子水中超声波清洗20 min，然后将电极置于强酸混合液（V（HNO3）∶V（HCl）∶V（H2O）=1∶3∶4）中浸泡10 min，最后再在去离子水中超声波清洗20 min。将预处理后的GCE浸置于CS溶液（体积分数2%，1%醋酸溶解）中，静置2 min（恒电位为-3.0 V），使GCE表面吸附有带有正电荷的CS分子，再用去离子水柔和清洗GCE探头，用以去除游离的CS；将吹干后的电极浸置于二氧化硅悬浮液（50 mg/mL）中，静置2 min，清洗后再将电极浸置于CS溶液中，静置2 min清洗后将电极浸置于ALB分散液（50 mg/mL）中，静置2 min，清洗备用。此过程为修饰电极的1 次循环，即在电极表面吸附有一层二氧化硅和一层ALB，此双层膜即定义为(ALB/SiO2)1。通过增加实验循环数，将多个双层吸附于电极表面，此类型的修饰电极即为GCE-(ALB/SiO2)n。1.3.4 电化学行为分析

首先，考察用于修饰电极的最适双层膜数量，将固定有不同数量双层酶膜GCE浸置于10 mL磷酸缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）（0.01 mol/L，pH 7.2）中，再向反应池中缓慢加入1 mL的ATChCl溶液（1 mmol/L），反应温度为37 ℃，采用循环伏安法测定不同修饰层数的GCE对酶催化底物过程中的电流响应特性，以氧化峰电流值的绝对值最高为宜。其次，考察电极修饰前后灵敏度的变化，将3 种类型的电极分别置于10 mL PBS（0.01 mol/L，pH 7.2）中，再向反应池中缓慢加入1 mL的ATChCl溶液（1 mmol/L），反应温度为37 ℃，采用循环伏安法测定并比较电极修饰前后对酶催化底物过程中的电流响应特性，以氧化峰电流值的绝对值最高为宜。最后，以敌敌畏作为有机磷农药的模型，修饰电极为核心元件，构建农药残留生物传感器检测体系。将修饰电极置于10 mL PBS（0.01 mol/L，pH 7.2）中，添加1 mL不同浓度的敌敌畏工作液，充分混匀后室温静置15 min。采用循环伏安法测定电流相应特征，根据不同浓度敌敌畏引起的电流变化，绘制抑制率曲线，计算抑制率与最低检出限，抑制率计算公式如下[5]：

式中：L是履带吸盘的最高点和最低点的距离；h是清洁机器人重心到工作平面的距离；G是清洁机器人的重力(N)；α是光伏面板与水平面的夹角；β是支撑点和几何重心的连线与工作平面法线的夹角，称为抗倾覆特征角，由清洁机器人的自身结构确定。

式中：I为抑制率/%；I0为GCE-(ALB/SiO2)n检测的氧化峰电流值（农药抑制）；I1为GCE-(ALB/SiO2)n检测的氧化峰电流值（无农药抑制）。

1.3.5 选择性检测

选择常见农药吡虫啉、乙草胺、溴氰菊酯和氟铃脲作为干扰物质代表（1 mmol/L（亚硝酸钠浓度10 倍），50%乙醇溶液溶解），以氧化峰电流值的绝对值为指标，评估该传感器检测以敌敌畏为模型的有机磷和氨基甲酸酯类农药（0.1 mmol/L）的选择性。

1.3.6 实际样品的检测

以黄瓜、小白菜和苹果作为实际被测样品。称取适量的新鲜黄瓜、小白菜新鲜叶片和苹果，使用保鲜膜封好，4 ℃放置过夜。使用时将果蔬切碎，分别称取5 g置于烧杯中，加入10 mL PBS（0.1 mol/L pH 7.0）浸提，测定时离心吸取上清液，分别向3 种果蔬上清液中加入不同浓度的敌敌畏。检测时加入底物ATChCl至1 mmol/L，记录电流响应数值，计算抑制率，重复测定5 次，考察检测体系的加标回收率，并通过组内偏差和组建偏差分别评价传感器检测果蔬样品中农药残留的精确度和重复性。

1.4 数据处理

每组数据均重复5 次，利用Origin 9.0软件处理数据作图。采用DPS 7.05软件对数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 ALB的表征

图 1 ALB构建示意图Fig. 1 Schematic diagram of ALB

ALB构建流程见图1。采用脂质体纳米技术，构建ALB，内含AChE和荧光黄指示剂；利用Porin在脂质体外层的磷脂分子层上创建孔道，构造出反应物进出的门户；当农药加入体系后，会通过孔道进入到反应器内部，与AChE的活性结构特异性结合，从而抑制酶活性；当底物出现时，丧失活性的AChE无法催化底物产生电信号物质（胆碱和乙酸），与此同时，产生的乙酸会降低反应器内部的酸碱度，使得荧光黄指示剂显色（pH＜6.8）。通过电信号的改变和颜色变化，可定量定性分析有机磷农药。

图 2 ALB的扫描电子显微镜图（A）和激光共聚焦显微图（B）Fig. 2 SEM (A) and CLSM (B) images of ALB

由图2A可知，所制备的AChE的脂质体粒径大小分布均匀，分散性良好；外壁粗糙，没有明显缺陷，彼此挤压处呈现出一定的形变，此现象充分证明了脂质体磷脂层的机械强度和物理弹性，该结构可有效保持脂质体的稳定性，不易溶胀。激光粒度分析结果表明，ALB的平均粒径约为（7.26±0.75）µm。为进一步确定ALB是否将AChE与荧光指示剂包覆其中，采用激光共聚焦电子显微镜进行表征。由图2B可知，可清晰观察到所制备的ALB具有绿色荧光内核，初步证明酶反应体系已被成功包覆于脂质体中。ALB经清洗后，采用甲醇原液溶胀破碎ALB，再测定AChE活性，可进一步确定是否包覆成功。结果表明，5 组脂质体的活性包封率的平均值为89.5%，相对标准偏差为1.18%，经过计算，1 mg的ALB中的平均AChE包覆量约为0.21 mg。采用Porin在ALB的磷脂分子层表层进行打孔，构建反应底物和电信号物质进出的孔道。参考预实验的结果，并结合本实验之前的研究成果[8]，在本研究的Porin用量下，所产生的孔道可通过分子质量10 000 kDa以下的物质，满足本实验的要求。通过Zeta电位仪检测，ALB的表面电位为-78.6 mV，表面带有负电荷。

2.2 最适(ALB/SiO2)n酶膜层数的筛选

本环节实验中，分别设定酶膜层数n值为1～10 个双层，即制备体系1～10 个循环。以不同层数酶膜修饰电极所响应的氧化峰电流值的绝对值为评估指标，确定最适酶膜层数。由图3可知，当n值在1～5范围内时，氧化峰电流的响应峰值的绝对值呈现逐渐上升的趋势；当n为6时，峰电流值的绝对值也达到了最大值为16.8 μA；当n在7～10之间时，峰电流值的绝对值逐渐下降，说明修饰电极的酶膜所固载的ALB达到饱和阶段，催化固定量底物时已无产生更多的电信号[23-25]。综上所述，确定n为6，即所构建的传感器核心电极为GCE-(ALB/SiO2)6。

图 3 不同层数酶膜修饰电极的最大响应电流Fig. 3 Effect of number of layers of enzyme-loaded films on maximum response current of modified electrode

2.3 纳米多层酶膜的表征

为观察多层酶膜内部结构，采用金属针对酶膜进行打孔处理。由图4A可知，ALB微球与纳米二氧化硅通过层层自组装过程而逐层吸附排列。通过表层的ALB微球分布可以了解到，ALB牢固镶嵌在纳米二氧化硅层中，这种分布保证了多层酶膜的机械稳定性，不易出现溶胀断层和修饰电极时的基底效应[21]。

图 4 多层酶膜的扫描电子显微镜图Fig. 4 SEM micrographs of enzyme-loaded films

2.4 GCE-(ALB/SiO2)6的电化学行为分析

选用3 种电极（裸电极、无二氧化硅修饰电极和多层酶纳米膜修饰电极）的循环伏安曲线进行比较研究，评估修饰前后电极性能的改变。由图5可知，当底物ATChCl没有加入到反应体系时，3 种类型的工作电极都没有产生明显氧化还原峰，说明没有产生电化学响应，体系中未发生酶催化反应（图5曲线a～c）。而当添加底物溶液时（1 mmol/L），图5曲线e～f 3 种类型的工作电极的特征氧化峰显著增加，表明体系中发生了酶催化反应，造成了电子的迁移，电信号开始进行传递。酶膜的修饰的电极（图5曲线d和f）的氧化峰电流的绝对值明显高于裸电极（图5曲线e），说明采用酶膜修饰电极的电化学性能较优。其中，图5曲线f具有最高的氧化峰电流值的绝对值，说明GCE-(ALB/SiO2)6具有最好的电化学响应性能，也同时说明了酶膜中的纳米氧化硅可以极大程度地提高整个修饰电极的电化学响应性能，增强电子的离穴传导性，这与其他的研究结果相似[13]。

图 5 裸GCE、GCE-(CS/ALB)5和GCE-(ALB/SiO2)6电化学行为Fig. 5 Cyclic voltammograms of bare GCE, GCE-(CS/ALB)5 and GCE-(ALB/SiO2)6

2.5 GCE-(ALB/SiO2)6对农药的响应

有机磷农药可特异性抑制ALB中AChE的活性，阻碍其催化底物ATChCl，产生电信号。当底物浓度固定时，伴随着农药添加量的提高，体系的氧化峰电流数值的绝对值会随之下降，进而判断体系中有机磷农药的残留[26-28]。本环节实验采用循环伏安法评估构建的GCE-(ALB/SiO2)6修饰电极对有机磷农药敌敌畏的快速响应。如图6所示，由于AChE的催化活性被敌敌畏抑制，导致峰电流值的绝对值下降。当农药残留浓度由10-5mol/L下调至10-12mol/L时，峰电流绝对值由11.7 μA提升至16.7 μA。农药残留浓度在10-10～10-12mol/L区间内，峰电流变化趋于平缓，说明修饰电极中酶抑制反应已非常微弱，电信号输出达到饱和值。

图 6 修饰电极对不同浓度敌敌畏的响应Fig. 6 Effect of different concentrations of dichlorvos on response current of electrode

图 7 抑制率拟合曲线Fig. 7 Fitted curves for dichlorvos inhibition

由图7可知，敌敌畏浓度与抑制率在两个浓度范围内存在良好的线性关系，这与其他研究类似[19,21,24]。在敌敌畏浓度在0.25～1.75 μmol/L范围内时，抑制率回归方程为I=28.58C+5.35，相关系数R2为0.998 7。在2～10 μmol/L的范围内抑制率回归方程为I=2.38C+51.25，相关系数R2为0.999 5。根据工作曲线方程计算（3s/b）检出限为（0.72±0.065）μg/L，远低于饮用水国家限量标准的10 μg/L有机磷农药最大残留量。根据本研究中传感器所获得的检出限，与其他基于AChE生物传感器的研究作比较，结果见表1。由表1可知，本研究的传感器最低检出限为（0.72±0.065）μg/L（3×10-10mol/L），与其他研究中检测有机磷和氨基甲酸酯类农药相比具有相对较低的检出限，说明该类型生物传感器具有良好的灵敏度。

表 1 GCE-(ALB/SiO2)6与其他基于AChE的生物传感器检测农药的性能对比Table 1 Comparison of GCE-(ALB/SiO2)6 and other biosensors based on immobilized AChE used for detection of pesticides

2.6 GCE-(ALB/SiO2)6的检测选择性

选择4 种常见的非有机磷和氨基甲酸酯类农药，分别是吡虫啉、乙草胺、溴氰菊酯和氟铃脲参与此传感器的选择性研究。在传感检测体系中分别添加4 种农药的工作液，使其终浓度分别为1 mmol/L，高于敌敌畏10 倍，以双蒸水代替农药作空白对照，结果见图8。结果表明，空白对照的峰电流值的绝对值为23.8 μA，这是在ALB中AChE完全没有受到抑制的情况下催化底物产生的电流响应；与此同时，吡虫啉、乙草胺、溴氰菊酯和氟铃脲4 种农药分别产生的峰电流值的绝对值与空白对照非常接近，说明4 种农药都没有对AChE产生明显抑制；敌敌畏的检测过程中峰电流的绝对值只有14.5 μA，同时说明了该体系对敌敌畏所代表的有机磷和氨基甲酸酯类农药具有检测的特异性。

图 8 GCE-(ALB/SiO2)6选择性检测敌敌畏Fig. 8 Selectivity of GCE-(ALB/SiO2)6 toward dichlorvos versus other tested pesticides

2.7 GCE-(ALB/SiO2)6检测实际样品

在果蔬样品的PBS浸提液中，加入敌敌畏标准液，使得体系中的农药质量浓度分别为0.1、0.25 μg/mL和0.5 μg/mL。采用制备好的酶生物传感器检测果蔬中农药的残留，用以确定传感器对果蔬样品中不同浓度敌敌畏的加标回收率和精密度，每组实验重复测定5 次，结果见表2。结果表明，加标回收率在94%～105%之间，且组内相对标准偏差皆在5%以下，符合检测体系标准（12%以下），说明该传感检测体系具有良好的加标回收率和精密度。

表 2 GCE-(ALB/SiO2)6检测样品中不同浓度敌敌畏的回收率和精密度Table 2 Recovery and precision (RSD) of GCE-(ALB/SiO2)6 for different concentrations of dichlorvos

根据敌敌畏检测工作曲线，分别测定质量浓度为0.025、0.05、0.1、0.25 μg/mL和0.5 μg/mL的敌敌畏在果蔬中的残留。根据5 次重复实验的电流响应数值，通过组间标准偏差，衡量此类传感器在检测果蔬样品中敌敌畏残留的重复性。由表3可知，组间相对标准偏差在2%～4%之间，说明GCE-(ALB/SiO2)6在检测敌敌畏残留的过程中具有良好的重复性。

表 3 GCE-(ALB/SiO2)6检测样品中不同浓度敌敌畏的重复性Table 3 Repeatability of GCE-(ALB/SiO2)6 for different concentrations of dichlorvos

3 结 论

本实验旨在建立快速检测果蔬中有机磷和氨基甲酸酯农药残留的电化学型酶纳米生物传感器。本研究发现，所制备的ALB微结构表面没有明显缺陷，活性包封率达到89.5%，并能够有效保持内环境中AChE活性；利用层层自组装技术所构建的GCE-(ALB/SiO2)6相比于GCE-(CS/ALB)5具有更加优越的检测灵敏度，进一步说明了纳米氧化硅作为固载材料时的良好性能；在检测实际样品的过程中，GCE-(ALB/SiO2)6针对敌敌畏的残留体现出良好的灵敏度、精确度、选择性和重复性。本研究将为食品中农药残留检测方法的改进积累基础资料。