双孢蘑菇培养料理化指标及酶活与其产量相关的多重分析

蔡盼盼，张文强，张昊琳，王清辉，张国庆，陈青君※

（1. 北京农学院植物科学技术学院农业应用新技术北京市重点实验室，北京 102206； 2. 承德兴春和农业股份有限公司，滦平 068250； 3. 北京农学院生物科学与工程学院农业部都市农业（北方）重点实验室，北京 102206）

0 引 言

双孢蘑菇味道鲜美，是一种高蛋白、低脂肪、低热能的健康食品，深受世界各国人民的喜爱[1-2]。中国是双孢蘑菇生产大国[3]，栽培上以引进荷兰双孢蘑菇的栽培模式为主，采用隧道式发酵技术制作双孢蘑菇培养料[4]。发酵包括2个时期：一次发酵和二次发酵。一次发酵期间，物料温度上升到 80 ℃，使麦秸软化[5]；二次发酵时期进行巴氏灭菌处理（60 ℃），随后在45～50 ℃下调节约4～5 d，再将温度降至约25 ℃[6]。巴氏灭菌杀死一些有害微生物、线虫、昆虫等，调整期发酵物料中的氨气逐渐被释放，大量的有益微生物繁殖，为双孢蘑菇菌丝的生长做准备。发酵物料理化性状直接关系到双孢蘑菇的品质和产量[7]。研究发现，在一次发酵期间，小麦秸秆碳水化合物，如纤维素和木聚糖仅在有限的程度上被降解；在二次发酵期间，高达50%的物料碳水化合物被代谢[5]。二次发酵期间秸秆的木质纤维素成分和微生物生物量发生很大变化[8-9]，发酵的过程是微生物菌群演替的过程，微生物产生可降解木质纤维素的酶，其中羧甲基纤维素酶（CMC）、纤维二糖酶、葡聚糖酶等参与分解纤维素，木聚糖酶、木糖苷酶、α-阿拉伯糖酶等参与分解半纤维素[10-12]。Jurak等[13]在双孢蘑菇子实体生长期间的培养料提取物中检测到内切葡聚糖酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶和木糖苷酶活性，Patyshakuliyeva等[14]发现子实体生长期间最丰富的纤维素酶是纤维二糖水解酶、葡聚糖酶和 β-葡萄糖苷酶，半纤维素酶有木聚糖酶、木糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、葡萄糖苷酶等，木质素降解酶有漆酶、锰过氧化物酶等，在子实体形成阶段，纤维素降解 35%，半纤维素降解50%，木质素降解40%[5]。高晓静等报道在物料发酵期间纤维素和半纤维素的利用率可达到 40%～60%[15]，但木质纤维素及其酶活对产量的影响未见报道。Kariaga等研究表明物料发酵过程中的生物、理化因素影响蘑菇菌丝对培养料的选择[16]。Sharma和Kilpatrick依据双孢蘑菇发酵物料的质量因素预测子实体的潜在产量，研究的数据包括物料的含水量、pH值、含氮量、含碳量和铜、铁和钠含量等[17]一般常见参数，结果表明决定物料质量的因素是多个因素的组合，但对木质纤维素组分、相关降解酶等参数与产量的关系没有提及。

针对前人对双孢蘑菇发酵培养料质量相关因素的研究结果，本研究采用隧道式发酵技术进行双孢蘑菇培养料的发酵处置，测定双孢蘑菇培养料二次发酵结束后 13个理化指标及酶活，包括水分、pH值、EC、含碳量、含氮量、木质纤维素各组分含量和酶活，以及双孢蘑菇产量，运用主成分分析、聚类分析和多元回归分析等多变量分析方法，探究双孢蘑菇培养料二次发酵结束后各理化指标及酶活对产量形成的作用和相对重要性，为评价和筛选双孢蘑菇高产发酵培养料指标提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验采样于2017年7－12月在河北省承德市滦平县兴春和农业股份有限公司双孢蘑菇工厂进行。

发酵原料包括黍草、稻草、麦草、玉米芯、鸡粪、石膏、豆粕等，采用隧道式发酵技术制作发酵物料，第1～3天将草料、玉米芯、鸡粪放入混料池混合后建堆；第4～15天入一次发酵隧道，中间倒仓3次，并在每次倒仓时根据当前含水量补充水分至 75%左右[18]；一次倒仓时加入石膏、豆粕；第16～22天转入二次发酵隧道。二次发酵结束后发酵物料接种双孢菇菌种，按照工厂化栽培工艺进行菇房管理，栽培菌种为 Sylven A15。试验所需培养料样品取自二次发酵结束后，从隧道前、中、后断面各8个点取样混合；结合原料来源和配合当地工厂生产，依据23:1～25:1碳氮比[19]制作原料配方，10批次配方如表1所示；重复3次测定；每批菇房生产期栽培管理一致，通过双孢蘑菇专用空调和可编程逻辑控制器（programmable logic controller，PLC）智能化控制系统严格控制和调节双孢蘑菇不同生长时期的温湿度、CO2体积分数和风压风量。菌丝生长期间料温控制在23～25 ℃[20]，空气达到饱和含水量，CO2体积分数在0.5%～1%；子实体生长时，菇房里的空气温度保持在16～18 ℃[21]，空气相对湿度85%～95%[18]，CO2体积分数保持在0.08%以下。菇床面积为900 m2，统计每批菇房产量。

表1 工厂化物料发酵原料配方Table 1 Formula of factory composting raw material

1.2 试验方法

采用pH计和电导率仪测定pH值、电导率值。用干燥称质量法测定含水量。用半自动凯氏定氮法[22]测定含氮量。利用灼烧质量法测定灰分及含碳量。采用滤袋法[23]测定样品的纤维素和半纤维素含量。用DNS（3,5-二硝基水杨酸，3,5-Dinitrosalicylic acid）显色法测定培养料中木聚糖酶酶活、羧甲基纤维素酶（CMC）酶活[24-25]。对硝基苯酚法测定纤维二糖水解酶、β-木聚糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶酶活[26-28]。

1.3 数据处理

用 Excel 2007 进行数据处理，计算平均值、标准差，再利用SPSS19.0对二次发酵结束后培养料各理化性质及酶活进行主成分分析、聚类分析，并用多元回归分析[29]研究其与产量的相关性。

2 结果与分析

2.1 二次发酵料理化性质和相关酶活与单位面积产量

对10批二次发酵结束后的含水量、pH值、EC值、含碳量、含氮量碳氮比等理化性质和羧甲基纤维素酶（CMC）、木聚糖酶、木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、纤维二糖酶、纤维素和半纤维素相对含量分别进行测定。由于堆肥期间木质素几乎不降解，分解木质素的相关酶活性较低[5]，本次研究结果未列出。结果如表2、表3所示。

表2 二次发酵料理化性质与双孢蘑菇单位面积产量Table 2 Physicochemical properties of secondary fermentation material and yield per unit area of Agaricus bisporus

表3 二次发酵后培养料纤维素、半纤维素含量及相关酶活Table 3 Content of cellulose and hemicellulose in secondary fermentation materials and related enzyme activities

10批二次发酵的培养料含水率在65.54%～72.26%之间，pH值7.39～8.16偏弱碱性，EC值在2.05～3.37之间，氮质量分数大多都在1.88%～2.08%，仅1批较低为1.62%，碳氮比大多都在17.10～18.55，有3批碳氮比较低，分别为 14.48:1、15.06:1、16.41:1，总体符合双孢蘑菇二次发酵料生产的要求[30-31]；羧甲基纤维素酶活在1.85～2.89 U/mmol之间，木聚糖酶活在 8.24～13.52 U/mmol之间，木糖苷酶活在 23.76～52.77 U/μmol之间，α-阿拉伯呋喃糖苷酶活在82.74～254.85 U/μmol之间，差异较大；α-纤维二糖酶活在 15.81～39.21 U/μmol之间；纤维素质量分数9.40%～19.38%不等，半纤维素质量分数在 5.95%～14.93%；单位面积产量为 18.11～26.42 kg/m2。为进一步明确双孢蘑菇二次发酵培养料各种酶活、理化性状与产量的关系，采用主成分分析、聚类分析、多元回归分析进一步分析。

2.2 主成分分析

主成分分析（principal component analysis，PCA）主要通过降维的方法，用较少的指标来代替和综合反映原来较多的信息[32]，提取出数据要表达的信息的主要成分。特征值的大小代表了矩阵正交化之后所对应特征向量对于整个矩阵的贡献程度。以特征值大于1为标准[32]在13个参数中提取出4个主成分，累积贡献率达84.04%，可代表原始因子所代表的大部分信息。因子载荷矩阵是各个原始变量的因子表达式的系数，代表提取的公因子对原始变量的影响程度。根据0.5原则，主成分1包括纤维素质量分数、半纤维素质量分数、碳质量分数、碳氮比，贡献率为31.18%，主要是与碳水化合物的变化的相关参数；主成分2包括羧甲基纤维素酶、木糖苷酶、α-纤维二糖酶，贡献率为18.45%，CMC、α-纤维二糖酶主要分解纤维素，木糖苷酶外切木聚糖主链，成分 2与培养料中纤维素和少量半纤维素降解有关；主成分3包括EC值、氮质量分数，贡献率为18.34%，培养料中的氮源经过微生物的代谢转化为可供蘑菇菌丝利用的形态，EC值反应了培养料中可溶性盐浓度，过高则影响菌丝对矿质元素的吸收，皆为影响发酵物料质量的重要指标；主成分 4主要是含水率、木聚糖酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、pH值，贡献率为16.08%，含水率的多少影响料堆中氧气的流通和微生物的活动，间接影响秸秆的降解，木聚糖酶在分解木聚糖中起主要作用，α-阿拉伯呋喃糖苷酶则分解木聚糖侧链，pH值影响培养料中微生物的生长，主成分4在降解半纤维素中起主要作用（表4）。

表4 主成分因子载荷矩阵Table 4 Principal component factor load matrix

2.3 聚类分析

聚类分析（CA）依据事物的数值特征观察样品间的亲疏关系，而样品间的亲疏关系由样品之间的距离衡量，一旦定义了样品间的距离，就把距离近的样品归为一类[32]。用SPSS19.0计算13个指标之间的欧氏距离[33-34]，将各样本的距离映射到0～25之间，构建聚类图（图1）。

图1 聚类分析树状图Fig. 1 Cluster analysis tree

由图1看出，当距离临界值取18时，成分因子聚为4类。第1类：纤维素质量分数、半纤维素质量分数、碳质量分数、碳氮比、木糖苷酶活、α-纤维二糖酶活、羧甲基素纤维素酶（CMC）活性，降解纤维素的CMC、α-纤维二糖酶以及降解少量半纤维素的木糖苷酶活性影响纤维素、半纤维素降解，从而影响纤维素、半纤维素的质量分数，即第一类与碳水化合物的变化有关；第 2类：EC值、氮质量分数，与主成分分析的成分3相一致，为影响二次发酵培养料质量的重要指标；第3类：含水率、木聚糖酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶，在降解半纤维素中起主要作用；第4类：pH值，培养料中适宜的酸碱环境对微生物和双孢蘑菇菌丝的生长有重要影响。

2.4 多元回归分析

逐步回归分析是分别把每一个变量都选入模型中，每次都保留系数显著水平最高的那个变量，剔除不显著的变量，通过多次的选入和剔除最终得到系数的显著的回归方程。随机选取9批样品，以二次发酵后的13个指标为自变量，以单位面积产量为因变量进行逐步回归分析，得到的最优回归方程为：

单位面积产量(kg/m2)=10.134+2.762×CMC 酶活(U/mmol)+1.248×木聚糖酶酶活(U/mmol)-0.566×纤维素质量分数×100%（R=0.969，F=25.857，P=0.002）

模型拟合优度系数为0.969，接近于1，拟合优度较高，方差检验 F=25.857对应的 P＜0.05，回归方程显著成立。由回归方程模型分析可知，二次发酵结束后的木聚糖酶酶活、羧甲基纤维素酶活、纤维素含量对双孢蘑菇产量有密切影响，木聚糖酶酶活、羧甲基纤维素酶活与双孢蘑菇产量存在正的线性关系，纤维素质量分数与双孢蘑菇产量存在负的线性关系。将剩下的 1批样品CMC酶活2.25 U/mmol、纤维素质量分数13.66%、木聚糖酶酶活 13.21 U/mmol带入计算单位面积产量为25.10 kg/m2，与实际产量26.42 kg/m2相差不大，相对误差绝对值不到5%，说明回归方程的预测效果较好。

3 讨 论

在实际生产过程中，各个阶段培养料的理化性质是蘑菇种植者判断其优劣的重要依据[35]。本研究采取10批不同原料通过二次发酵制造双孢磨菇培养料，在所测的各理化性质中，聚类分析的EC值、氮质量分数的分类与主成分分析一致，二者在主成分分析中贡献率达18.34%，为二次发酵料中的重要检测指标。微生物经过发酵作用将培养料中的氮源转化，供双孢蘑菇菌丝生长，氮质量分数的高低都会影响子实体的质量和产量，而EC值的大小影响菌丝对盐离子的吸收。聚类分析中pH值也占据重要的一类，是影响双孢蘑菇产量的关键因素。pH值的高低影响堆肥中微生物和双孢蘑菇菌丝的生长，大多数微生物最适宜生长的环境为中性或弱碱性，二次发酵后物料pH值在7.2～7.7，培养料内菌丝发满后pH值在6.2～6.6时最适宜双孢菇菌丝的生长[36]。本试验10批料pH值在7.39～8.16范围，EC值在2.05～3.37之间，氮质量分数在1.88～2.08%，堆肥质量符合双孢蘑菇的生长要求。

堆肥中酶的活性影响纤维素、半纤维素的降解[37]，这些大分子物质必须经相应的酶分解成葡萄糖、果糖等单糖类和小分子化合物后才能被吸收利用，为双孢蘑菇生长提供所需的碳源。有研究发现纤维素、半纤维素降解与酶活性变化有关，酶活性高降解速率就快，酶活性低降解速率就慢[38-39]。但关于酶活作为培养料指标的重要性和占有的份量少有报道。本研究表明，对纤维素降解起作用的 CMC、α-纤维二糖酶和分解少量半纤维素的木糖苷酶在主成分分析中贡献率为18.45%，对降解半纤维素中起主要作用的木聚糖酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶与含水率、pH在主成分分析中贡献率为16.08%。因此，酶活可作为二次发酵料质量重要的检测指标。

碳水化合物是蘑菇利用的主要营养物质。本研究的聚类分析中，纤维素质量分数、半纤维素质量分数与碳质量分数、碳氮比以及少量纤维素降解酶归为一类，在主成分分析中纤维素质量分数、半纤维素质量分数、碳质量分数、碳氮比作为主成分1贡献率达31.176%，足以说明其重要性。

含水率的多少影响发酵微生物的活力，进而影响酶的活性。发酵成熟后，培养料的含水率应达到 67～70%[40]，在63.5%时，嗜热微生物量最多，含水率的增加或降低都会使其减少[41]。本研究中主成分 4主要是含水率、木聚糖酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、pH值，贡献率为16.08%，聚类分析也将含水率、木聚糖酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶归为一类，均说明含水率的重要性以及与降解半纤维素的密切关系。

主成分和聚类 2种分类方式的结果中也存在不同的部分。在与碳水化合物变化有关的分类上，主成分分析的结果中含有纤维素质量分数、半纤维素质量分数、碳质量分数、碳氮比，聚类分析分类结果中除了这 4个指标外还有CMC、α-纤维二糖酶等少量酶；主成分分析的主成分4中包括含水率、木聚糖酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、pH值，而聚类分析将含水率、木聚糖酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶分为一类，将pH值单独分为一类。2种分类方式运算方式不同造成了分类结果的不完全相同。主成分分析将变量通过线性变换转换为两两不相关的变量，方差最大的一组线性组合称为第 1主成分，次大的一组称为第 2主成分，依次类推。各主成分的贡献率反应了原始数据的信息量占全部信息量的比例，分析结果较客观、合理。但要保证提取的主成分累计贡献率达到较高水平。聚类分析是按照选定的方法计算每两类之间的聚类统计量，将关系最为密切的两类合为一类，再与最相似的变量或小类合并，有时实践中会发现他们在数据中有紧密的关系，但事物之间却无任何内在联系。聚类分析本身却无法识别这类错误。聚类分析的结果直观简明，适合对样本的简单分类；主成分分析适用于对目标降维，便于数据的进一步观察和处理。在本研究中，主成分分析的结果更为可信。

单位面积产量与二次发酵料的13个指标进行多元回归分析的结果表明：羧甲基纤维素酶活、木聚糖酶酶活与双孢蘑菇产量存在正线性关系，纤维素质量分数与双孢蘑菇产量存在负线性关系。纤维素、半纤维素被降解成可供菌丝生长利用的小分子物质，与双孢蘑菇子实体的生长及产量有密切的关系。实际生产中可以采用测定羧甲基纤维素酶活、木聚糖酶酶活和纤维素质量分数来评价发酵料的质量，并预测产量。

4 结 论

1）通过主成分分析在二次发酵料的 13个指标中提取出 4个主成分，贡献率分别为 31.176%、18.45%、18.34%、16.08%，累积贡献率达84.04%，可代表原始因子所代表的大部分信息。4个主成分可分为：碳水化合物因子；主要的纤维素降解酶类；EC值、氮质量分数；主要的半纤维素降解酶类。其结果客观合理，更为可信。

2）聚类分析在距离临界值取18时将13个指标聚为4类：碳水化合物变化因子；EC值、氮质量分数；半纤维素降解酶类；pH值。其分类结果与主成分分析结果不完全相同但都将纤维素质量分数、半纤维素质量分数、碳质量分数、碳氮比以及少量纤维素降解酶等碳水化合物因子归为一类。

3）利用多元回归分析建立二次发酵培养料指标与单位面积产量的关系式，单位面积产量与CMC酶活和木聚糖酶酶活呈正线性关系，与纤维素含量呈负线性关系（回归模型R=0.969，P＜0.05），拟合效果较好，验证相对误差绝对值＜5%。实际生产中可以采用测定二次发酵培养料的羧甲基纤维素酶活、木聚糖酶酶活和纤维素质量分数来预测双孢蘑菇可能的产量。