青鱼Dazl基因的原核表达及其多克隆抗体制备

王艺舟，潘启华，王 乾，夏必琳，罗君志，方 健，邓 羽，廖明聪，陈天圣，2

(1.华中农业大学水产学院，农业部淡水生物繁育重点实验室，武汉 430070；2.水产高效健康生产湖南省协同创新中心，湖南常德 415000)

Dazl(Deleted in Azoospermia-like)基因是DAZ基因家族的一员[1-3]，其编码RRM(RNA recognition motif)RNA结合蛋白，是动物生殖细胞中非常重要的翻译调控因子[4-5]。Dazl基因最早由Eberhart从蝇类睾丸组织中获得，是一个性腺特异性表达的基因[3]。在成体动物睾丸组织中，Dazl主要分布于精原细胞和初级精母细胞的细胞核中，而在粗线期精母细胞中则主要分布在细胞质中，这揭示了在减数分裂中Dazl完成了从精原细胞的细胞核向次级精母细胞的细胞质内迁移的过程[6]。Dazl表达的增加或下降显著影响生物体的发育和生殖[7]，在非洲爪蟾(Xenopuslaevis)中XDazl基因的缺失会导致原始生殖细胞的形成受到阻碍[8]；小鼠(Musmusculus)Dazl基因敲除后，发现雌性生殖细胞只能停滞在第一次减数分裂前期，而雄性生殖细胞在有丝分裂过程中就会受到影响，最终导致雌雄双方都无法产生成熟配子[9]；在人类中，Dazl基因的缺失或突变会导致精子缺乏症和男性不育[6]。

Dazl基因在鱼类中的研究报道主要集中在斑马鱼(Daniorerio)[10]、青鳉(Oryziaslatipes)[11]、牙鲆(Paralichthysolivaceus)[12]、鲤鱼(Cyprinuscarpio)[13]、半滑舌鳎(Clariasgariepinus)[14]、亚洲鲈鱼(Asianseabass)[15]、中华鲟(Acipensersinensis)[16]等，其研究内容主要集中在RNA水平的表达和与原始生殖细胞的形成等关联，Dazl蛋白只在青鳉、鲤鱼、中华鲟等少数鱼类中有报道[11，13，16]，但是鱼类Dazl抗原保守性不高导致抗体不能跨物种使用。我们聚焦于青鱼(Mylopharyngodonpiceus,Mp)的生殖细胞研究，青鱼是我国传统的“四大家鱼”之一，2017年的中国渔业统计年鉴结果表明青鱼总产量位于全国淡水鱼产量的第8位[17]，其具有个体大、生长速度快、肉质鲜美等优点，但其繁殖周期较长，目前关于青鱼的研究主要集中于人工繁殖[18]、养殖[19]、营养[20]、抗病[21]、资源分布[22]等方面，对于在生殖细胞c方面的相关研究少有报道。Dazl是许多生物中生殖细胞的形成和配子发生所必需的翻译调控因子，是生殖细胞中特异表达的分子标记。本实验室已经在青鱼卵巢中分离和鉴定Dazl基因，将其命名为MpDazl(GanBank: KY829471)，本研究在此基础上开展青鱼Dazl蛋白原核表达、抗体的制备以及抗体特异性的验证，为下一步研究青鱼生殖细胞的分离和标记奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

大肠杆菌(Escherichiacoli)TOP 10和BL21购自北京全式金生物技术有限公司；载体pCS2、pET-28a、pT2BH-pr、pFastBac均为本实验室保存或构建；青鳉肌肉细胞系(OLM)由本实验室建立并保存；青鱼购自武汉水产市场。

1.2 实验方法

青鱼Dazl原核表达载体的构建与鉴定 根据实验室已获得的pCS2-MpDazl质粒和pET-28a载体的酶切位点分析结果，利用Primer 5软件设计引物(Mp-Dazl-cds F 5′-AAAGCTAGCATGGTTTTAGATATGGATATCCAG-3′/ Mp-Dazl-cds R 5′- AAACTCGAGCAGAAGGGTTAGCAAAGTC-3′)。以pCS2-MpDazl为模板进行PCR扩增，利用DNA胶回收试剂盒(Omega，美国)回收纯化PCR产物，将回收产物与pET-28a质粒进行NheI和XhoI(NEB，美国)在37 ℃酶切后于进行回收于16 ℃连接。将连接产物转化到大肠杆菌TOP 10后，挑取克隆后用质粒提取试剂盒(Omega，美国)提取质粒pET-28a-MpDazl，所提质粒进行酶切鉴定并测序。

Dazl原核表达和表达条件优化 将pET-28a-MpDazl转化至BL21菌中，挑取阳性克隆接种到LB液体培养基中培养12 h，再次接种至新鲜LB培养基中至OD600 mm为0.6～0.8时，利用IPTG诱导表达后，通过离心回收菌体，在菌体中加入20 μL蛋白上样缓冲液(CW0052S，康为世纪)煮沸10 min，离心后取上层液体20 μL进行SDS-PAGE(康为世纪)电泳分析。表达条件优化：(1)将已获得的阳性菌液按照1%的浓度接种到LB液体培养基中37 ℃培养1 h，以终浓度为0.5 mmol/L和1 mmol/L的IPTG分别诱导3 h；(2)将已获得的阳性菌液按照1‰的浓度接种到LB液体培养基中37 ℃培养1 h，以终浓度为0.5 mmol/L的IPTG诱导，在25 ℃和37 ℃分别诱导2、3、4 h后取样，以确定最佳诱导时间和温度。

融合蛋白表达形式鉴定 将含有pET-28a-MpDazl重组质粒的菌液离心并去上清，以1/10菌液体积的PBS重悬沉淀，冰浴中超声波破碎菌体，超声条件为功率400 W超声5 s间隔10 s至菌液澄清，收集上清和沉淀，分别进行10% SDS-PAGE电泳分析。

融合蛋白抗体制备与效价检测 将含有pET-28a-MpDazl菌体诱导蛋白，大量表达蛋白后取沉淀用尿素洗脱纯化后[23-24]，将弗氏佐剂加入到纯化好的蛋白中，选取2只健康的白兔将乳化好的产物分别进行背部多点皮下注射。第一次免疫7 d，后续每隔两周加强免疫一次，4次免疫后取血分离血清。利用ELISA反应，测定抗体效价。武汉爱博泰克生物科技有限公司协助完成蛋白纯化和免疫等工作。

多克隆抗体特异性检测 取青鱼的脑、眼、心、肾、肝、脾、卵巢各0.5 g，用蛋白提取试剂盒提取总蛋白，检测多克隆抗体是否特异识别青鱼卵巢组织中的蛋白[23-24]。多克隆抗体检测青鳉肌肉细胞系(OLM)表达的外源MpDazl蛋白，将已构建对照质粒pT2BH-pr和表达外源MpDazl蛋白Dazl的pFastBac-MpDazl质粒分别转染OLM细胞中，检测其中Dazl蛋白表达情况。转染前将OLM细胞以1×106个/孔接种于六孔板中，28 ℃培养箱中培养。24 h后用LipofectamineTM2000(Invitrogen，美国)进行转染，每孔加6 μL转染试剂及2 μg质粒，48 h后在倒置荧光显微镜下观察并拍照。用蛋白抽提试剂盒提取不同转染细胞蛋白，进行Western blot分析。

2 结果

2.1 青鱼Dazl原核重组载体的构建与鉴定

以质粒pCS2-MpDazl为模板扩增MpDazl编码区(coding sequence, CDS)。将扩增出的MpDazlCDS 648 bp产物与pET-28a载体分别用NheI和XhoI双酶切，酶切产物经T4连接酶连接构建了原核表达载体pET-28a-MpDazl(图1A、B)，原核表达载体pET-28a-MpDazl经酶切后依次得到大小为5 543 bp和406 bp的片段，均与预期长度一致(图1C)。将构建的载体送测序，确定插入片段准确无误。

图1 MpDazl原核表达载体构建

2.2 Dazl融合蛋白的表达和诱导条件优化

将pET-28a-MpDazl载体转入大肠杆菌中，其经过IPTG诱导后通过SDS-PAGE电泳分析，结果表明有约27 kD的目的条带。IPTG诱导浓度优化结果显示，在0.5 mmol/L和1 mmol/L的IPTG诱导条件下pET-28a-MpDazl融合蛋白表达量无明显差异(图2A)，因此选择0.5 mmol/L IPTG浓度进行诱导表达。IPTG诱导时间和温度优化结果表明不同温度无明显差异，在诱导2、3、4 h后各融合蛋白均有一定的表达，其中在诱导4 h目的蛋白表达量最高，所以选择4 h进行大量诱导(结果未显示)。

图2 His-Dazl融合蛋白表达的优化

2.3 Dazl融合蛋白表达及纯化

pET-28a-MpDazl菌体蛋白以上清和包涵体两种形式存在，其主要分布在包涵体中(图2B)。诱导pET-28a-MpDazl菌体蛋白大量表达后用尿素洗脱纯化，通过蛋白电泳后采用软件分析，灰度其纯度达90%以上，能够满足后续抗体制备需求。

2.4 多克隆抗体特异性检测及应用

所得青鱼Dazl多克隆抗体效价为1∶256 000(表1)，可以进行抗原的特异性识别。抗体对不同浓度抗原的识别结果表明抗体能有效地检测抗原(图3A)。原核表达的蛋白提取液和表达内源Dazl的组织蛋白提取物Western blot分析结果表明所制备多克隆抗体可特异识别菌体裂解液中目的蛋白(图3B)；并且能特异识别青鱼卵巢Dazl蛋白，这也证明Dazl蛋白具有性腺表达的特异性(图3C)。此外，将pT2BH-pr和pFastBac-MpDazl质粒分别转染OLM细胞中均能检测到红色荧光(图4A、B)。转染后OLM细胞蛋白Western blot结果显示，在转染pFastBac-MpDazl的细胞后能检测出表达的Dazl蛋白(图4C)。通过以上结果说明制备的兔抗青鱼Dazl多克隆抗体能够有效识别原核表达的Dazl蛋白、内源的Dazl蛋白和真核细胞过表达的Dazl蛋白，可用于后续研究中的Dazl蛋白检测。

表1 ELISA检测Dazl抗体效价

图3 多克隆抗体特异性检测

图4 多克隆抗体应用于转染细胞蛋白检测

3 讨论

本实验采用原核表达系统，成功构建青鱼Dazl基因的原核重组表达载体pET-28a-MpDazl，在大肠杆菌中获得带有组氨酸标签的Dazl重组蛋白。为了有效地获得重组蛋白，从IPTG浓度、温度和诱导时间三个方面对表达条件进行优化。结果表明，温度与IPTG浓度无显著性差异，诱导4 h后蛋白表达量最高。考虑到高浓度的IPTG和大肠杆菌生长的最适温度这两个因素可能会影响大肠杆菌的生长，所以选择37 ℃，0.5 mmol/L IPTG和诱导4 h为获得His-Dazl重组蛋白的最佳条件。SDS-PAGE电泳结果表明，His-Dazl重组蛋白在菌体沉淀中表达最多，表明重组蛋白主要以包涵体的形式存在。我们在最适条件下大量表达了重组蛋白，并在蛋白变性的条件下用8 mol/L尿素纯化。包涵体氢键在尿素的作用下有很强的可逆性变性作用，当尿素浓度8～10 mol/L时，包涵体的溶解度可达70%～90%。选用尿素溶解的优点是它具有非离子化，呈中性，低成本等特点，而且复性后的蛋白不会导致大量蛋白质沉淀[25]。以纯化的蛋白作为抗原，免疫家兔制备His-Dazl多克隆抗体。ELISA分析结果表明，抗体效价高达256 000。His-Dazl抗体与原核表达的蛋白进行杂交，在约为27 KU处有一条明显的单一条带，说明制备的多克隆抗体能特异性识别重组蛋白；在青鱼不同组织蛋白中只有在性腺中检测到目的条带，这说明其能特异性地识别青鱼卵巢组织中的Dazl蛋白；我们还建立了过表达Dazl基因的鱼类细胞系，在其中也检测到目的条带，结果表明其能识别外源c表达的Dazl蛋白。因此以上结果都说明制备的青鱼Dazl抗体特异性好。

在斑马鱼[10]、青鳉[11]、鲤[13]、半滑舌鳎[14]、亚洲鲈[15]、中华鲟[16]、罗非鱼[26]等物种中也陆续研究Dazl，Dazl的RNA或者蛋白都局限于性腺中表达，均能说明它是生殖细胞特异的分子标记。本研究使用制备的抗体检测了Dazl蛋白在青鱼不同成体组织中的表达情况，也证实了该蛋白在性腺中特异表达。该结果与之前Dazl蛋白在鱼类和哺乳动物中所得到的研究结果类似，同时也暗示Dazl蛋白在青鱼的性腺发育和分化中起着重要的调控作用，为后期研究Dazl蛋白在青鱼生殖细胞中的应用奠定基础。