RNA干扰Gas2基因对低温胁迫下罗非鱼肾脏细胞系增殖及凋亡的影响

杨长庚，文 华，王美姿，陆 星，蒋 明，田 娟，喻丽娟

(1.中国水产科学研究院长江水产研究所，武汉430223；2.岭南师范学院生命科学与技术学院，广东湛江 524048)

环境因子例如温度、光照、盐度、溶解氧等能够制约鱼类的生长繁殖[1]。其中，温度对鱼类生长发育的影响尤为明显。针对温度对鱼类生理影响的研究从鱼类的形态、生理、生化到分子等各个方面均有研究[2-5]。

罗非鱼(Oreochromisniloticus， tilapia)，原产于非洲，属鲈形目丽鱼科罗非鱼属，为温水鱼类，其生长温度范围为16～38 ℃，适温范围22～35 ℃，耐低温能力较差[6]，是仅次于鲤科和鲑科鱼类的世界第三大养殖品种，在热带和亚热带地区具有广泛的养殖[7]。目前，中国已成为世界最大的罗非鱼养殖国家。然而，受其耐低温能力差的影响，我国罗非鱼的养殖受到气候与温度的制约，导致了其南北地理位置分布极不均衡。因此，如何提高罗非鱼耐低温能力已成为其增养殖产业发展所面临的重要问题之一。目前，已有一些关于低温对罗非鱼的影响以及罗非鱼耐低温性能的研究[8-9]。而针对罗非鱼的影响，前期，我们从低温胁迫罗非鱼的数字基因表达谱中筛选到一个受低温胁迫影响的基因-生长抑制特异性基因2(growth arrest specific 2 gene， Gas2)[10]。Gas2是微丝系统的组成成分，在进化过程中高度保守，主要起着在凋亡过程中调节微丝和细胞形态变化作用[11-12]。此外，P53基因能与细胞骨架相互作用[13-14]，P53基因又是一种肿瘤抑制基因，能够促进细胞凋亡。由此，本研究利用Gas2基因的shRNA(short hairpin RNA)转染罗非鱼肾脏细胞系，并对转染后的罗非鱼肾脏细胞进行低温胁迫，通过检测Gas2基因及P53 mRNA的表达变化、以及低温胁迫下细胞的增殖及凋亡情况，从而进一步认识TLGas2(Tilapia Gas2)基因的功能，加深我们对罗非鱼在低温胁迫下的响应机制的理解，为培育耐低温罗非鱼以及研制抗低温基因产品等提供重要的理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料

罗非鱼肾脏细胞系(SKC)(长江水产研究所保藏，中国)；pGPU6/ GFP/Neo-gas2 shRNA 载体(上海吉玛制药技术有限公司，中国)；MEM 培养基和胎牛血清(Gibco公司，美国)，LipofectaminTM 2000试剂盒(Invitrogen公司，美国)；WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(碧云天生物技术研究所，中国)，Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(碧云天生物技术研究所，中国)；TRIzolReagent (Invitrogen 公司，美国)；FastKing RT Kit (With gDNase)(天根生化科技(北京)有限公司，中国)；FastFire qPCR PreMix (SYBR Green)(天根生化科技(北京)有限公司，中国)。

1.2 方法

1.2.1 short hairpin RNA (shRNA)表达载体选择

根据Gas2基因序列设计三条shRNA序列。委托上海吉玛制药技术有限公司使用pGPU6/Neo载体构建shRNA表达质粒(shG1， shG2， and shG3)。根据前期转染罗非鱼肾脏细胞系检测干扰效率，筛选出shG3载体[15]。shRNA序列如下：5′ GATCCAAAAAAGCCAATGATCCACCTTGCAGATCTCTTGA

ATCTGCAAGGTGGATCATTGGC 3′。

1.2.2 细胞培养、转染及低温胁迫

将罗非鱼肾脏细胞(TKC)常规培养于含10%胎牛血清的MEM培养基中，置于细胞培养箱中25 ℃进行培养。培养TKC细胞至对数生长期，调整细胞密度，分别接种于6孔板(用于提取mRNA)，24孔板(用于细胞凋亡检测)或96孔板(用于细胞增殖检测)中。当融合度为80%左右时按LipofectaminTM 2000试剂盒说明书进行转染，在25 ℃下继续培养。设置阴性对照组(Nc)及Gas2干扰组(RNAI)，分别转染shNc对照质粒和shG3干扰质粒。转染24 h后，按照5 ℃/d的降温速率，将培养温度降至10 ℃。分别在25 ℃，20 ℃，15 ℃，10 ℃检测Gas2基因和P53基因mRNA表达以及细胞增殖、凋亡情况。

1.2.3 总RNA提取、cDNA合成

分别在不同处理温度下将6孔板中细胞去其上清，用PBS洗两次后，每孔加TRIZOL试剂1 mL，消化5～10 min。小心吸取上清转入新的EP 管，加入氯仿200 μL，混匀至乳白色，冰上静置5 min，4 ℃，12 000 r/min离心15 min，小心吸取上清转入新的EP 管，加入异丙醇500 μL，上下颠倒摇匀，冰上静置10 min，4 ℃，12 000 r/min离心15 min，弃上清，向沉淀中加入75%乙醇1 mL，4 ℃，10 000 r/min离心5 min，弃上清，适当干燥，加入适量DEPC 水溶解，电泳检测后-80 ℃保存备用。分别以提取的总RNA 500 ng为模板，参照FastKing RT Kit (With gDNase)第一链合成试剂盒说明书合成cDNA。

1.2.4 实时荧光定量PCR

参照FastFire qPCR PreMix (SYBR Green)荧光定量预混试剂盒说明书，使用QuantStudio6 Flex系统进行实时荧光定量PCR，以18S RNA作为内参基因，每个样品设定3个重复，反应体系：2×SuperReal PreMix Plus 10 μL，正、反向引物(10 μmol/L) 各0.6 μL，cDNA 模板2 μL，RNase-Free ddH2O补足到20 μL。反应条件：95 ℃ 15 min，1 个循环；95 ℃ 10 s，60 ℃ 32 s，72 ℃ 32 s，40 个循环。相对定量分析采用2-Δ ΔCt的方法。

1.2.5 细胞增殖及凋亡检测

按照WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒说明书，孵育2 h后，分别对不同温度处理下细胞样品，每个样品设定3个重复，利用酶标仪BioTek Synergy2在450 nm测定吸光度。

按照Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒说明书，室温(20～25 ℃)避光孵育20分钟，分别对不同温度处理下细胞样品，利用流式细胞仪(Beckman CytoFLEX FCM)检测细胞凋亡，计算凋亡比率。

1.2.6 统计分析

使用SPSS 18.0软件中的单因素方差(One-way ANOVA)分析，分析各组数据的差异显著与否，P<0.05为差异显著。

2 结果

2.1 实时荧光定量PCR检测Gas2及P53基因的mRNA表达情况

如图1所示，低温胁迫下，RNAI组与Nc组中Gas2、P53基因mRNA表达与25 ℃相比在15 ℃和10 ℃时均显著升高。而RNAI组中P53基因mRNA的表达在20 ℃时与25 ℃相比变化不明显。Nc组中Gas2、P53基因mRNA表达在20 ℃时与25 ℃相比均显著升高。

在同一温度下时，RNAI组Gas2、P53基因mRNA表达均显著低与Nc组。

图1 干扰Gas2基因的罗非鱼肾脏细胞受低温胁迫时Gas2、P53基因mRNA表达变化情况

2.2 低温胁迫下抑制Gas2基因后细胞凋亡情况

随温度降低，RNAI组及Nc组的罗非鱼肾脏细胞凋亡率均明显升高。但是同时随着温度降低，与对照相比，RNAI组细胞凋亡率明显低于Nc组。见图2。

图2 流式细胞仪检测低温胁迫下罗非鱼肾脏细胞细胞凋亡情况

2.3 低温胁迫下抑制Gas2基因后细胞增殖情况

图3所示，随温度降低，RNAI组及Nc组的罗非鱼肾脏细胞增殖率均显著降低。在25 ℃及20 ℃时，RNAI组的细胞增殖率显著低于Nc组，而在15 ℃时，RNAI组的细胞增殖率显著高于Nc组。

图3 低温胁迫下罗非鱼肾脏细胞在不同温度下的增殖情况

3 讨论

温度尤其是低温与生物体组织器官发育、机体正常生理活动维持、免疫抑制等生理过程有密切关系[9， 16-17]。低温会造成鱼类从生理生化到分子遗传等多个方面的变化。例如：Carginale等[7]研究发现，南极岩石鳕鱼通过两种不同策略实现低温下高效消化食物蛋白质来适应低温环境：一是通过基因复制，提高酶产量以弥补在冷胁迫下转录效率的降低；另一个是通过表达一类在低温下特异表达的低温胃蛋白酶来提高食物的消化效率。Yao 等[18]2012 年对贻贝Mytilus edulis的研究结果表明，在贻贝中低温胁迫与高温应激均依赖caspase-3，并提出在高温以及低温下的DNA 损伤与之后的应激反应(例如诱导细胞凋亡)之间存在必然的因果联系。在细胞水平上，低温胁迫可以导致细胞肿胀、膜破损，造成细胞坏死[19]，而且还能引发细胞内一系列复杂的基因表达变化和生理反应，抑制细胞增殖，使细胞周期发生改变，并诱导细胞凋亡[20-21]。细胞水平的影响主要包括低温影响细胞膜流动性，物质运输，导致细胞停止分裂生长，并进入凋亡阶段[22-23]。此外， 严文静等[24]研究短盖巨脂鲤Piaractus brachypomus发现， 低温导致一些鱼类细胞致死的途径是细胞凋亡。而这一系列影响，是建立在分子水平影响上的。因此，从细胞凋亡相关基因入手研究低温胁迫对鱼类的影响是很有必要的。然而，低温对罗非鱼组织细胞学方面的研究资料较少。

生长抑制特异性基因2(growth arrest specific 2 gene，Gas2)，是微丝系统的组成成分，主要起着调节微丝和细胞形态变化作用[11， 25]。同时，Gas2基因又是一个多功能的基因，参与着细胞的凋亡过程，一方面作为凋亡的效应分子，是caspase-3的底物，被caspase-3酶切，参与凋亡细胞的形态改变[12， 26]；另一方面，过表达的Gas2不直接引起细胞的凋亡，但是可以增加细胞对凋亡信号的敏感性[27]。我们的研究中，随温度降低，RNAI组及Nc组的罗非鱼肾脏细胞凋亡率均明显升高。并且在温度降至20 ℃以下细胞明显受到低温胁迫时，抑制了Gas2基因的罗非鱼肾脏细胞凋亡率与对照相比明显下降。说明低温不仅可以引起细胞的坏死，同时也能引起细胞凋亡。同时Gas2基因参与了细胞周期过程，在其中起到一定的作用，能够引起细胞凋亡的发生。随温度降低，RNAI组及Nc组的罗非鱼肾脏细胞增值率均显著下降，也说明了低温对正常细胞周期的负面影响。如图3所示，Gas2干扰组与阴性对照组的罗非鱼肾脏细胞的增殖水平在低温胁迫下均显著降低，但Gas2干扰组的下降趋势与阴性对照组相比更为平缓，尤其在20～15 ℃区间的增殖水平降低较少。并且，在温度降至20 ℃以下细胞明显受到低温胁迫时，抑制了Gas2基因后的罗非鱼肾脏细胞其增殖率显著高于对照组，更说明Gas2基因对细胞凋亡的调控作用，抑制Gas2基因后可以抑制细胞凋亡的发生。

已有研究发现Gas2在体内与m钙蛋白酶结合，抑制m钙蛋白酶的活性，从而使P53稳定性增加[27]。而P53基因是一种肿瘤抑制基因，其控制着细胞周期的启动，能够促进细胞凋亡。我们的研究中，P53基因的表达也随着Gas2基因的表达发生变化。这可能是因为P53基因能与细胞骨架有相互作用[13-14]，而Gas2基因是微丝系统的组成成分，抑制Gas2基因后，同时也引起了P53基因的表达变化，降低P53基因表达，从而进一步影响细胞凋亡。

Gas2基因能够影响P53基因表达，在罗非鱼细胞凋亡过程中具有一定作用。抑制Gas2基因后，罗非鱼肾脏细胞在受低温胁迫时，能够降低细胞的凋亡率，增加细胞的增殖。