育成期舍饲蓝狐结肠菌群多样性分析

■陈双双 司华哲 蔡熙姮 张如春 张新宇 史鸿鹏 李光玉 刘晗璐*

（1.中国农业科学院特产研究所，吉林长春130112; 2.吉林农业大学，吉林长春130118）

蓝狐（Alopex lagopus），食肉目，犬科，是我国饲养的主要裘皮动物之一。蓝狐肠道较短，仅为体长的3.5～4 倍，食物在肠道中停留时间短，排空速度快[1]。随着产业发展，目前在蓝狐繁殖育种、疾病防控、营养需要量、毛皮发育等方面开展了大量的研究[2-5]，但对于蓝狐的肠道微生态系统及功能的研究较少。肠道微生物区系作为动物体最复杂的微生态系统，被称为动物重要的代谢“器官”，参与机体营养物质的消化吸收及能量代谢过程，而且参与机体的免疫过程，并对动物健康具有重要影响[6-9]。本团队前期研究发现，河北昌黎地区雄性蓝狐粪便微生物中以厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门、变形菌门、梭杆菌门为主，其中厚壁菌门含量最高。在属水平上以链球菌属、乳杆菌属、普雷沃菌属、巨型球菌属、柯林斯菌属为主[10]。但对于饲养条件下蓝狐肠道微生物的组成与分类仍未得到充分研究，此外关于蓝狐肠道菌群与宿主营养物质利用的研究也很缺乏，本研究作为蓝狐肠道菌群组成及功能研究的一部分，运用高通量测序及数据分析技术，研究蓝狐肠道菌群的组成，为未来蓝狐营养物质利用乃至日粮调配提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

2018 年8 月从吉林地区的农业部长白山野生生物资源重点野外科学观测试验站随机选取6 只健康（精神状态正常、采食均衡、生活环境良好）的育成期（3～4月龄）雌性舍饲蓝狐（J1～J6），对其心脏注射5 ml的琥珀乙酰胆碱处死后，立即取结肠后段内容物。现场采集15 g蓝狐结肠后端内容物，立即用无菌分装袋收集分装于5 ml的冻存管中（分装于3个管，每管5 g），放入液氮罐中速冻后带回实验室，备后续分析。蓝狐饲粮为养殖场中日常饲粮，日粮组成及营养水平满足育成期蓝狐营养需要，如表1所示。

表1 蓝狐饲粮组成及营养水平（风干基础，%）

1.2 样品处理

1.2.1 细菌总DNA的提取及测序

对蓝狐结肠食糜样品中细菌基因组DNA的提取按照Fast DNASPIN as Kit for Feces 说明书进行[10]。提取的基因组DNA 经1%的琼脂糖凝胶电泳（电压120 V，电泳23 min，Marker 为λⅢDNA Maker）检测，DNA 产物在14 000 bp 左右。将目的DNA 送至北京诺禾致源科技股份有限公司，基于IonS5TMXL测序平台，利用338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）引物对目的基因的V3～V4 区进行单端测序（Single-End），利用单端测序的方法构建小片段文库。

1.2.2 生物信息学分析

使 用Cutadapt（V1.9.1,http：//cutadapt.readthedocs.io/en/stable/）先对reads 进行拼接、过滤去杂得到有效信息有效数据（Clean Reads）。利用Uparse 软件(Uparse v7.0.1001，http：//www.drive5.com/uparse/)Clean Reads 进行聚类，设定具有97%以上相似度的序列为1 个操作分类单元（OTU），对OTUs 序列进行物种注释，用Mothur方法与SILVA132（http：//www.arb-silva.de/）的SSUrRNA数据库数据库进行物种注释分析，并在各分类水平下统计不同培养基中蓝狐粪便菌群组成。使用Qiime软件（Version 1.9.1）计算Alpha指数和Beta 指数，并用R 软件（Version 2.15.3）对不同培养液中的细菌组成进行组间差异性分析以及组间差异物种分析。

1.3 数据处理

数据用Excel 2013进行整理并用SAS 9.4软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 多样性指数分析

本研究基于高通量测序技术对6 只健康蓝狐结肠菌群的16S rDNA 的V3～V4 区进行测序。6 个样品共获得377 798 条有效序列，平均为62 966 条有效序列，其中J1 的有效序列数最少为46 921 条，J6的有效序列数最多为80 249 条。在97%相似度下进行聚类分析，共获得2 064 个OTU，平均为307 个OTU。

Alpha 多样性指数分析表明，蓝狐结肠菌群物种具有较高的多样性和丰度。如表2 所示，其中Ace 指数（范围为216～416，均值312）和Chao1 指数（范围为201～393，均值296）为菌群物种丰度指数，Shannon指数（范围为2.30～5.37，均值4.31）和Simpson 指数（范围为0.649～0.953，均值0.869）为菌群物种多样性指数。

表2 样本测序数据分析

图1 稀释曲线（A）和等级聚类曲线（B）

如图1(A)所示，当测序数量超过25 000 时，各样本曲线逐渐趋于平缓，说明测序数据量合理，更多的数据量只会产生少量新的物种。等级聚类曲线（Rank Abundance）作为常见的描述组内样本多样性的曲线，可直观的反映样本中物种的丰富度和均匀度[11]。如图1(B)所示，随着测序的深入，在水平方向上，曲线在横轴上的跨度较大，物种的丰富度高；在垂直方向上，曲线趋于平缓，因此物种分布均匀。

2.2 门分类水平下菌群结构分析

图2可见，在门分类水平上分析，6个样本获得的所有菌群归类于12 个门，主要集中在厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门（Proteobacteria），含量均在1%以上，其中厚壁菌门为最优势菌门。厚壁菌门平均含量为70.25%，拟杆菌门平均含量为22.36%，变形菌门平均含量为5.69%，放线菌门平均含量为1.13%，4 个菌门共占99.43%。

图2 蓝狐肠道菌群门分类的相对丰度

2.3 属分类水平下菌群结构分析

在属分类水平上分析，6 个样本获得的所有菌群归类于180 个菌属，图3 为前30 的菌属的相对丰度图，表3 为前10 的菌属所占比例。菌属中比例大于1%共有15 个，其中乳杆菌属（Lactobacillus）为最优势菌属，平均含量为28.50%；其次为巨单胞菌属（Megamonas），平均含量为7.48%；随后依次为拟普雷沃菌属(Alloprevotella)占7.41%；Peptoclostridium占6.33%；乳球菌属（Lactococcus）占5.38%；Dialister占4.39%；巨型球菌属（Megasphaera）占3.53%；Desulfovibrio 占2.97% ；拟 杆 菌 属（Bacteroides）占2.48%；unidentified_Lachnospiraceae占2.38%，前10个菌属共占70.85%。具体属分类水平的相对丰度见图3。

图3 蓝狐肠道菌群属分类的相对丰度

3 讨论

蓝狐作为食肉动物，对高蛋白质、高脂肪的动物性饲料有较高的利用率[12-13]。研究发现，蓝狐可耐受脂肪比例高达44%的日粮，而未见任何生理异常[13]，该现象是否与蓝狐肠道微生物存在联系仍需进一步研究。因此，本试验利用高通量测序技术，对蓝狐结肠菌群的组成与多样性进行分析。

3.1 多样性指数分析

Alpha 指数用于分析样本菌群多样性，反映样本中细菌的多样性和丰度[14]。Ace 指数和Chao1 指数反映菌群中物种丰度，其值越高则菌群中物种丰度越高；Shannon 指数和Simpson 指数反映菌群中物种多样性，其值越高则菌群中物种多样性越丰富[11]。覆盖率（Coverage）代表样品微生物群落被测出的概率[15]。如表2 显示，本试验样品测序覆盖率都在0.997 以上，说明本试验样品测试结果真实可靠。如图1 所示，随着测序数量的增加稀释曲线趋于平坦，则说明随着测序深度的增加几乎不产生新的OTU。本试验中OTU 均值为307，Ace 指数均值为311，Shannon 指数均值为4.31。本团队前期对河北昌黎地区的雄性蓝狐粪便中菌群进行了高通量测序分析，OTU 均值为509，Ace 指数均值为559，Shannon 指数均值为5.27[10]。与河北地区蓝狐肠道菌群相比，蓝狐肠道菌群中具有较低的物种丰度与多样性，这中差异可能来自地域、日粮组成、年龄、性别以及测序方式带来的差异。表1 所示，蓝狐J5、J6 的Ace 指数和Chao1 指数较高为401、416 和393、386，则表明J5和J6两只蓝狐结肠微生物中具有较高的丰度。J3的Shannon 指数和Simpson 指数最低，则J3 结肠中微生物群落的多样性最低。通过Alpha 指数分析表明，与其它蓝狐相比，蓝狐J3 结肠中菌群具有较低的丰度和多样性，其原因可能与动物个体的生理状态和遗传因素有关。

表3 蓝狐肠道不同菌属所占比例(%)

3.2 菌群结构与物种丰度分析

从门分类水平分析，蓝狐结肠前五的优势菌门为Firmicutes、Bacteroidetes、Actinobacteria、Proteobacteria、梭杆菌门（Fusobacteria），与狼、豺、家犬等犬科动物肠道菌群研究结果一致[16-19]。6 只蓝狐中J3、J6结肠中最优势菌门Firmicutes 所占比例高达98.17%、89.02%。研究发现，Firmicutes 与脂肪、蛋白质的消化有关，蓝狐作为以高蛋白质、高脂肪的动物性饲料为食的肉食动物，因此，Firmicutes 有促进日粮营养消化吸收的作用[20-22]。研究表明，Bacteroidetes 与类固醇、胆汁酸、糖类代谢有关，对多糖的吸收和蛋白质的合成具有促进作用[23]。大量研究发现，在动物肠道中Firmicute s 和Bacteroidetes 的比例与动物个体的肥胖程度有关，肥胖个体肠道中Firmicutes 的比例升高、Bacteroidetes 的比例下降，当动物肠道中Firmicutes 丰富度增加，Bacteroidetes 丰富度降低时，发现饮食过程中动物体对能量的摄入量增多[23-25]。因此，蓝狐J3、J6 个体对脂肪和蛋白质等具有较强的吸收能力，但本试验并未对蓝狐体重水平进行观察。蓝狐、水貂同为我国主要的毛皮动物，研究表明，水貂结肠菌群中较丰富的5 个菌门为Firmicutes(60.0%)、Bacteroidetes(16.2%)、Fusobacteria（11.5%）、Actinobacteria（5.9%）和Proteobacteria(5.3%)[26]。与蓝狐结肠菌群相比，水貂结肠菌群中Fusobacteria 所占比例较高，其它菌门种类与蓝狐结肠菌门类似。研究发现，在动物肠道中Fusobacteria 所占比例与动物饲粮中纤维含量有关，当饲粮中纤维含量较少时，Fusobacteria 所占比例增加[27]。与水貂饲粮相比，蓝狐饲粮中纤维含量较高，因此可能导致蓝狐结肠菌群中Fusobacteria所占比例较低。同时，研究发现，草食动物马的肠道菌群中没有发现Fusobacteria细菌的存在[28]；而人肠道菌群中Fusobacteria 所占比例不足1%[29]。因此，动物肠道中Fusobacteria 所占比例可能受饲粮中植物性饲料组成的影响。

从属分类水平分析，蓝狐结肠菌群中优势菌属为Lactobacillus、Megamonas、Alloprevotella、Peptoclostridium、Lactococcus、Dialister、Megasphaera、Desulfovibrio、Bacteroides、unidentified_Lachnospiraceae，而蓝狐粪便菌群中的优势菌属为Streptococcus、Lactobacillus、Prevotella、Megasphaera、Collinsella、Blautia、Bacteroides、Alloprevotella、Peptoclostridium、Megamonas，与蓝狐粪便菌群结果存在差异性，其原因可能与蓝狐地域、品种、年龄、性别等有关系[30-32]。Lactobacillus 属于Firmicutes，其作为益生菌受到人们的广泛关注。研究发现，在动物体中，Lactobacillus存在于动物体的许多部位，如消化系统、泌尿系统和生殖系统，构成微生物群的重要组成部分[33]。在动物肠道中Lactobacillus代谢物丁酸钠以及有机酸等的存在，引起肠道内环境pH 值的降低，抑制有害菌的生长；Lactobacillus 能产生过氧化氢，在体外和体内抑制白色念珠菌的生长和毒力，并通过减少白念珠菌生物膜的形成来降低其致病性[34]。体外研究也表明，Lactobacillus 通过产生有机酸和某些代谢物来降低白色念珠菌的致病性[35]。研究发现，Lactobacillus 与其他益生菌联合使用可帮助治疗肠易激综合症(IBS)，当肠道微生物群中条件致病菌含量过高时，益生菌可以恢复体内微生物菌群的平衡[36-37]。此外，Lactobacillus作为益生菌还可治疗由溃疡引起的幽门螺杆菌感染[38]。Lactococcus 原属于Streptococcus的N1群的一种菌属，其唯一产物乳酸可调节环境条件pH值，从而阻止腐败细菌的生长，但国内外鲜有报道[39-40]。Bacteroides在动物肠道中主要参与动物蛋白质、氨基酸和脂肪的代谢，当日粮中蛋白质和动物脂肪含量高时会使Bacteroides 比例提高[41]。与河北昌黎地区蓝狐相比，吉林左家地区蓝狐结肠菌群中Prevotella、Blautia含量减少。研究发现，Prevotella主要参与植物蛋白质的代谢，同时在瘤胃中还具有分解纤维素的能力[42]；Blautia在瘤胃中主要具有降解半纤维素的能力[43]，两种菌属的比例与动物的日粮有关，当日粮中纤维素水平增加时，该类菌群含量增加，但该类细菌在蓝狐肠道中的作用仍有待进一步研究确定。与河北昌黎地区蓝狐粪便菌群组成相比，吉林左家地区蓝狐结肠菌群组成存在差异性的原因除饲养环境、品种和研究方法不同外，也可能是饲粮配方不同造成的[44]。属水平上个体间差异性分析显示，J3结肠菌群中Peptoclostridium所占比例较高，其它菌属所占比例较低；J2 和J4 结肠菌群中Lactobacillus 所占比例较低，同时J2结肠菌群中Alloprevotella所占比例较高。研究发现在生活环境、性别、年龄、饲粮水平相同的情况下，动物肠道菌群组成和多样性还受到动物的遗传因素的影响[33]。因此，即使在相同环境下的不同个体间肠道中的微生物群落的组成和多样性也可能存在一定的差异性。

4 结论

本试验饲粮条件下的6 只蓝狐结肠菌群分布于12 个菌门，主要为Firmicutes（70.25%）、Bacteroidetes(22.36%)、Proteobacteria(5.69%)、Actinobacteria(1.13%)，4个菌门共占99.43%；所有菌门分布于180个菌属，组成丰富多样化的肠道菌群，在属的分类水平上Lactobacillus所占比例最高，为28.50%；其次为Megamonas，占7.48%。