Lnk基因敲除对葡聚糖硫酸钠诱导小鼠结肠炎的影响

张艳青,华 婧,郭俊荣,朱明明,钱佳丽,徐月节,许叶旻,邓 彬

(1.扬州大学医学院 病理生理教研室,江苏 扬州,225009;2.扬州大学附属医院 消化内科,江苏 扬州,225012)

溃疡性结肠炎(UC)是一种炎症性肠病，其发病机制尚不清楚。研究[1]认为感染、免疫、遗传因素是该病的可能发生机制，目前尚无有效治疗方法。人类Lnk基因位于12q24,它编码575个氨基酸，其翻译的产物Lnk蛋白(SH2B adaptor protein3,SH2B3),属于接头蛋白SH2B家族的一员。Lnk蛋白结构主要包括富含脯氨酸的氨基酸区域、PH结构域、SH2结构域和C-末端保守的酪氨酸残基。Lnk蛋白主要表达于造血细胞和淋巴细胞。Lnk在淋巴细胞和血细胞生成过程中主要起负调节作用。在Lnk敲除小鼠中，B细胞和造血干细胞的产生显著增加[2]。最近有研究[3]表明,Lnk可调控炎症相关的免疫细胞增殖及活性，在维持肠道稳态中起关键作用，但Lnk在UC中的作用尚不清楚。为了了解Lnk蛋白与UC的关系，本研究选用Lnk敲除小鼠，采用葡聚糖硫酸钠(DSS)制作小鼠UC模型，观察Lnk蛋白对UC的影响，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

健康C57BL/6小鼠12只，购于扬州大学比较医学中心,Lnk敲除鼠12只，为江苏省非编码RNA基础与临床转化重点实验室所有。所有实验小鼠鼠龄6～7 周，体质量18～22 g。DSS购自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 分组及造模:12只C57BL/6小鼠随机分为2组，每组6只。野生型组(WT)为正常对照组，每日进饮用水及饲料，不做处理，共7 d;WT+DSS组为野生型小鼠结肠炎组，每日自由饮用2.5% DSS溶液，共 7 d。Lnk敲除鼠随机分为2组，每组6只。Lnk敲除鼠组(KO)为Lnk敲除小鼠，每日进饮用水及饲料，不做处理，共7 d;KO+DSS组为Lnk敲除小鼠结肠炎组，饮用2.5% DSS溶液，共7 d。实验过程中每天对各组小鼠进行称重、记录，观察小鼠排出粪便情况。7 d后取外周血，处死全部小鼠，留取结肠组织做组织切片。

1.2.2 结肠炎症的评价:为了评估结肠炎的严重程度，每天检测体质量变化率和小鼠粪便性状。体质量变化率=(每天体质量-实验第1天体质量)/实验第1天体质量×100%。正常小鼠粪便为干而小粒状，半稀便为糊状但不粘肛门，稀便为液状而且粘肛门。观察粪便颜色，是否有黑便及血便。小鼠肠组织切片观察结果评价参照组织损伤评分标准[4],包括表面上皮细胞缺失、隐窝腺体损坏、黏膜炎症细胞浸润，分为0～4分，其中0分表示组织学特征为无改变;1分表示局部较轻;2分表示局部中等程度;3分表示广泛中等程度;4分表示广泛且严重。

1.3 统计学处理

采用Graph Pad Prism 5软件进行数据处理和统计学分析，所有数据均以均数±标准差表示，组间差异采用q检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 小鼠一般状况

WT组与KO组小鼠反应灵敏，饮食、活动正常，毛发有光泽，无便血。WT+DSS组小鼠在饮用2.5% DSS溶液后第5～6天出现懒动、稀便、粪便发黑及便血，进食和饮水量减少。KO+DSS组小鼠于第4～5天出现上述症状，且症状加重。

2.2 小鼠体质量变化率

WT组与KO组体质量略有增加,WT+DSS组与KO+DSS组体质量均显著降低(P<0.05),其中KO+DSS组体质量变化率显著大于WT+DSS组(P<0.05)。见图1。

图1 各组小鼠体质量变化率

2.3 小鼠肠长度比较

WT组与KO组小鼠肠外形正常，肠长度分别为(9.70±0.16)cm与(9.13±0.98)cm,2组比较无显著差异(P>0.05)。WT+DSS组与KO+DSS组小鼠肠均有糜烂出血、淤血，长度分别为(6.77±0.17)、(5.10±0.25)cm,与WT组、KO组比较均显著缩短(P<0.05),其中KO+DSS组较WT+DSS组显著缩短(P<0.05)。见图2。

图2 各组小鼠肠的长度

2.4 肠组织切片观察

WT组与KO组肠组织切片显示肠组织黏膜完整，腺体结构清楚;WT+DSS组呈多病灶浅溃疡，炎性细胞浸润黏膜及黏膜下层;KO+DSS组呈多病灶浅溃疡，明显炎细胞浸润，累及肌层。各组肠组织苏木精-伊红染色法(HE)镜下表现见图3。

图3 各组肠组织HE染色镜下表现

2.5 小鼠外周血中调节性B细胞(Breg)的细胞频率检测

取WT小鼠和KO小鼠的外周血，采用CD19与黏蛋白域基因-1(TIM-1)以及CD19与CD1d阳性标记检测Breg细胞频率，发现KO小鼠外周血中Breg细胞频率显著低于WT组(P<0.05)。见图4。

3 讨 论

UC是一种原因不明的慢性非特异性炎性疾病，临床主要表现为腹痛、腹泻、黏液脓血便等,UC病变通常累及直肠和乙状结肠，侵及黏膜及黏膜下层，呈连续弥漫性分布，病情轻重不一，迁延不愈，严重影响患者生活质量。UC的病因及发病机制尚未完全阐明，多数研究[5]认为与免疫、遗传、感染和精神等因素有关。以淋巴细胞为主的免疫细胞参与慢性非特异性炎症，与UC密切相关，而Lnk蛋白在淋巴细胞的扩增和功能中起关键调控作用。在对乳糜泻疾病的研究[6-7]中发现,Lnk基因多态性可使细胞产生对细菌感染的强烈反应，说明其对肠道具有抗细菌感染的保护性作用。因此,Lnk不仅可以作为UC的预测分子，也可以作为一个潜在的治疗靶点。

图4 野生型和Lnk敲除鼠外周血中Breg细胞频率比较

Lnk可防止CD8+T细胞过度增殖，在Lnk敲除小鼠中,CD44hiIFN-γ+CD8+T细胞增多，小肠绒毛变短。CD8+T细胞增殖能力增强，提示Lnk在免疫细胞介导的肠道组织损伤中具有一定作用[3]。Lnk可以调节树突细胞的产生和功能。Lnk敲除小鼠的脾和淋巴结中树突状细胞(DCs)数目增加，与野生型小鼠相比,Lnk敲除鼠的DCs促进T细胞从幼稚的CD4+T细胞向产生γ干扰素(IFN-γ)的Th1细胞分化的能力明显增强，产生IFN-γ的Th1细胞在细胞免疫中起重要作用，提示Lnk/SH2B3可以影响外周淋巴组织的细胞免疫应答反应[8]。除了以上免疫相关细胞外,Lnk对B淋巴细胞的生成过程也具有调节作用[9]。Lnk敲除小鼠脾脏中前B细胞和不成熟B细胞明显增多，说明Lnk可负调节B细胞的产生[10]。Lnk通过抑制IL-7/JAK/STAT信号通路抑制前B细胞增殖和白血病发展[11]。

本研究观察Lnk敲除后对小鼠结肠炎的影响，结果显示,Lnk敲除小鼠结肠炎的症状更加严重，同时还发现Lnk敲除小鼠外周血中Breg数量显著少于野生型小鼠。Breg是起负调节作用的B细胞亚群，可以抑制免疫反应，主要通过分泌白细胞介素-10(IL-10)行使其免疫负调控作用。研究[12]显示Breg参与包括UC在内的很多免疫紊乱性疾病的发生、发展。临床研究显示,UC患者外周血中的Breg细胞数量显著减少,IL-10产生明显减少。在T细胞受体α敲除小鼠自发性结肠炎模型中,B细胞可以通过产生CD1d上调Breg细胞产生IL-10的水平，保护结肠免于炎症损伤[13]。也有研究[14]显示脾脏B细胞暴露于肠道菌群时，可获得免疫抑制功能，通过IL-10依赖的途径抑制T细胞介导的结肠炎。在DSS诱导的小鼠结肠炎模型中，B细胞缺乏可使结肠炎加重，给予B细胞可减轻结肠炎症状，而且给予不产生IL-10的B细胞同样使结肠炎症状减轻，说明B细胞抑制肠道炎症反应也可以通过非IL-10途径实现[15]。

综上所述,Lnk敲除小鼠表现为更加严重的结肠炎症状，提示Lnk对于结肠炎的发生具有抑制作用，其机制可能与Lnk对免疫细胞的调节有关。本研究发现Lnk敲除鼠外周血中Breg细胞显著减少，而Lnk对于Breg细胞这一影响的具体机制还需要进一步研究探讨。