液态乳中胆固醇、7-脱氢胆固醇及25-羟基胆固醇的同步测定方法

卓成飞 胡盛本 邓泽元 刘 彪 叶文慧 李 静*

（1 南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室 南昌330047 2 伊利集团奶粉事业部技术研发部 呼和浩特010080）

胆固醇又称胆甾醇，是一种环戊烷多氢菲的衍生物，是动物组织中类固醇激素，胆汁酸、维生素D 的前体。动物的内脏、鱼子、蛋黄、牛奶中胆固醇含量较高。通常可以采用高效液相色谱法[1-2]、气相色谱法[3-5]、比色法[6-7]、超高效液相色谱法等方法测定[8-9]。胆固醇属于不饱和的化合物，在紫外、热、氧气等作用下容易被氧化生成胆固醇氧化物（Cholesterol oxidation products，COPs），主要包括25-羟基胆固醇、7-脱氢胆固醇、20-羟基胆固醇、7-酮基胆固醇。大部分胆固醇氧化物具有很多负面作用，例如：COPs 可以增加血浆中内皮细胞的Ca2＋渗透率，对细胞有一定的毒害作用[10]，致突变性和致癌性，且主要作用于早期阶段[10-11]，导致固醇类化合物代谢紊乱[12]。然而，部分COPs 对身体也存在一定益处，例如：25-羟基胆固醇可以促进免疫细胞的活化，增加免疫介质的产生[13]，也可以促进膜细胞体外钙化[14-15]。7-脱氢胆固醇作为维生素D3 的前体，在日光或紫外线照射下可转变为维生素D3，具有调节钙、磷代谢的生物功能。

目前，国内食品中胆固醇的测定主要采用国标GB/T 22220-2008 测定食品中胆固醇的含量，该法采用60%的KOH 溶液和无水乙醇对样品中的胆固醇进行皂化[17]，石油醚和乙醚（体积比1∶1）提取皂化物。该方法中皂化所用有机试剂较多，提取时间长；其次，国标方法要求样本量为0.25～10 g，其胆固醇含量约为0.5～5 mg，换算为液态乳的体积大约为3.8～38 mL，不利于原料较少，较为珍贵的样品，例如母乳的测定；此外，对于含水量较高的液态乳，其胆固醇浓度较低，加入少量的皂化试剂即可完全皂化。可见，GB/T 22220-2008 中胆固醇皂化方法不适合含水量较高的液态乳和样本量较少的母乳样品中胆固醇的测定。作者拟基于GB/T2220-2008 方法，优化皂化方法，得到适合液态乳的最优皂化条件。

此外，前期试验表明，采用GB/T 22220-2008中液相色谱条件分离胆固醇、25-羟基胆固醇和7-脱氢胆固醇，当流速为1.0 mL/min 时，胆固醇的峰分离效果不佳，而当流速改为0.8 mL/min 时，可达到最佳分离效果。该液相条件对于胆固醇的定量、定性测定比较稳定，然而，对于同时测定样品中胆固醇、25-羟基胆固醇和7-脱氢胆固醇的稳定性不明确。

综上所述，基于GB/T 22220-2008 方法，本试验优化液态乳中胆固醇的皂化条件，并验证胆固醇、25-羟基胆固醇和7-脱氢胆固醇的液相色谱条件的回收率、稳定性、精密度和准确度，为液态乳中胆固醇、25-羟基胆固醇和7-脱氢胆固醇的定性和定量提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

材料：市售伊利纯牛奶，蒙牛优钙纯牛奶，天天阳光纯牛奶，成熟母乳、初乳（贮存于-80 ℃冰箱），伊利复原乳风味乳酸牛奶（原味），蒙牛风味酸牛奶（原味），天天阳光酸牛奶（原味），光明优倍鲜牛奶，婴儿配方奶粉（1 段：美芝宝；2 段：荷兰牛栏；3 段：惠氏），伊利高蛋白脱脂高钙奶粉，其中固态奶粉按包装上的说明冲配成液态奶。

试剂：正己烷、无水乙醇、氢氧化钾均为分析纯，乙腈、甲醇为色谱级。胆固醇标品，美国Sigmaaldrich 公司；25-羟基胆固醇标品、7-脱氢胆固醇标品，加拿大TRC 公司。碱液：2 mol/L KOH 乙醇溶液 （称取11.220 g KOH 用乙醇定容至100 mL）。

1.2 仪器与设备

FA2204B 电子天平，上海精科天美科学仪器有限公司；TDL-5-A 低速大容量离心机，上海安亭科学仪器厂；DF101B 数显集热式搅拌器，金坛市大地自动化仪器厂；HP 1100 高效液相色谱系统（配有可二极管阵列检测器和Rev.A.06.03 色谱工作站，美国安捷伦仪器公司）；涡流振荡器（QL-861 型，海门市其林贝尔仪器制造有限公司），水浴氮吹仪（DSY-V1 型，北京金科精华苑科技有限公司）

1.3 试验方法

1.3.1 高效液相色谱仪的工作条件[16-17]

1） 色谱条件 色谱柱：安捷伦Eclipse plus C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为纯甲醇，柱温35 ℃，流速：0.8 mL/min，进样量：10 μL，检测波长：205，227 nm，检测器：二极管阵列检测器（DAD）。

2） 胆固醇的含量计算 胆固醇含量用X（mg/100 g）表示，计算公式如下：

式中，C——样品胆固醇质量浓度（mg/mL）；V——样品中乙腈体积（mL）；m——量取1 mL 样品时称得的质量（g）。

3） 专属性试验[29]取线性相关系数下的胆固醇及胆固醇氧化物的3 个标准品混合液进样，记录液相色谱图。

4） 胆固醇、7-脱氢胆固醇和25-羟基胆固醇标准曲线的绘制 精密称取100 mg 胆固醇标准品，置于100 mL 容量瓶中，用色谱级乙腈定容得到1.0 mg/mL 储备液。精密量取储备液1，2，4，6，8，10 mL 分别置于10 mL 容量瓶，用色谱级乙腈定容。加乙腈定容，配制成0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL，经过滤膜（0.22 μm）后进样。以胆固醇峰面积为纵坐标，胆固醇质量浓度为横坐标，绘制胆固醇标准曲线。

7-脱氢胆固醇标准品溶液：精密称取10 mg 7-脱氢胆固醇标准品，色谱级乙腈定容至10 mL得到0.5 mg/mL 的储备液，再移取一定体积分别配制成0.01，0.02，0.05，0.10，0.15，0.20 mg/mL；经过滤膜（0.22 μm）后进样。以7-脱氢胆固醇峰面积为纵坐标，7-脱氢胆固醇质量浓度为横坐标，绘制胆固醇标准曲线。

25-羟基胆固醇标准品溶液：精密称取10 mg 7-脱氢胆固醇标准品，色谱级乙腈定容至10 mL得到0.5 mg/mL 的储备液，再移取一定体积分别配制成0.01，0.02，0.04，0.06，0.08，0.10 mg/mL，经过滤膜（0.22 μm）后进样。以25-羟基氢胆固醇峰面积为纵坐标，25-羟基胆固醇质量浓度为横坐标，绘制25-羟基胆固醇标准曲线。

5） 精密度 胆固醇：准确量取1 mL 牛奶，加入2 mL KOH 乙醇溶液，80 ℃皂化30 min，按上述操作，对皂化后的供试样品重复进样6 次。胆固醇氧化物：准确量取1 mL 成熟乳，用上述试验条件皂化和测定，同时对该样品重复进样6 次，分别对色谱图进行积分。以胆固醇和胆固醇氧化物（COPs） 的含量计算相对标准偏差 （RSD）。RSD（%）=标准偏差SD/平均值×100。

6） 回收率 准确称取一定含量的样品8 份，分别加入胆固醇标品0.00，0.06，0.12，0.18 mg，每个梯度做2 组平行样；7-脱氢胆固醇：以空白作为对照组，6 组加入0.01 mg 7-脱氢胆固醇标品作为试验组；25-羟基胆固醇：以空白作为对照组，6组加入0.02 mg 25-羟基胆固醇标品作为试验组。按照上述方法操作，提取胆固醇，再按照上述的液相条件测定，计算回收率。

回收率计算公式如下：

7） 稳定性 准确量取1 mL 样品，按照上述试验优化得到的方法进行皂化试验，在室温下放置，分别在0，1，2，4，8，24 h 各进样1 次，测定样品中的胆固醇和COPs 的含量。

8） 重现性 准确称取液体乳样品6 份，进行皂化，通过液相色谱测定牛奶中胆固醇、胆固醇氧化物的含量。

1.3.2 胆固醇的皂化 以1 mL 牛奶作为样品，2 mol/L KOH 乙醇溶液为皂化试剂，分别对皂化温度：50，60，70，80，90 ℃，碱液添加量：0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL；皂化时间：10，20，30，40，50 min 3个因素进行优化，按照上述条件反应，每隔5～10 min 振摇一下试管，使得样品与碱液混合均匀，充分皂化。

1.3.3 胆固醇皂化物的提取和浓缩 迅速取出1.3.2 得到的皂化样品，并用流动的冷水把样品温度降到常温，加入3 mL 正己烷，充分摇匀再静置，待样品分层，移取上层有机相转移到25 mL 的比色管中，再往原试管中加入6 mL 正己烷，重复萃取，把2 次分离得到的有机相集中到比色管中，水洗至中性，轻轻振荡，防止乳化，不利于两相的分层，上层有机相过无水硫酸钠柱转移至试管中。

收集到的有机相，用氮气吹干，再向小试管中加入600 μL 的色谱级乙腈，振荡摇匀过0.22 μm有机滤膜转移至进样瓶中，HPLC 待测。

1.3.4 正交试验 以胆固醇质量浓度为指标，以温度（A）、时间（B）、添加量（C）和空白4 个考察因素。精密称取样品1 mL，共9 组，置小试管中，按照1.3.2 和1.3.3 进行试验，按L9（34） 正交表分别进行提取，试验设计及结果见表1。不考虑交互作用，进行方差分析，结果见表2。

1.3.5 验证试验 按照正交试验的结果得到的优化组合，进行验证试验。

1.3.6 统计分析 用SPSS20.0 对数据进行分析以及图表绘制，检测结果用Mean±SD 表示；所有试验均重复3 次以上，并且用单因素方差分析比较均值，P＜0.05 为差异显著。

2 结果与分析

2.1 皂化条件的优化

2.1.1 单因素优化 通过单因素优化试验，如图1a，2 mL 2 mol/L KOH 乙醇溶液，80 ℃条件下皂化，皂化时间达到30 min 时，皂化效果达到最大值，测得胆固醇的含量为11.968 mg/100 g。皂化时间超过30 min 后，胆固醇的含量开始下降，这可能与胆固醇部分氧化有关。GB/T 22220-2008 的皂化需要1 h，本试验对皂化时间优化后只需30 min，皂化时间比GB/T 22220-2008 减少一半，提高了皂化效率。如图1b，当80 ℃下反应30 min，KOH 乙醇溶液添加量为2.0 mL 时，胆固醇含量达到最高（10.323 mg/100 g）。当碱液量继续增加时，胆固醇的含量没有明显变化。GB/T 22220-2008中加入了10 mL 60% KOH 溶液和30 mL 无水乙醇[17]，所消耗的有机试剂较多，本试验大大减少了液态样品胆固醇皂化试剂用量，节约试剂。如图1c，当以2 mol/L KOH 乙醇溶液为皂化试剂反应30 min，皂化温度为80 ℃时，胆固醇的含量最大10.824 mg/100 g；当温度达到90 ℃时，皂化效果显著下降，可能是由于高温导致乙醇挥发加快，皂化液中的有效成分损失，导致皂化效果下降。考虑在皂化效果基本一致的条件下，温度过高会导致样品中胆固醇的氧化。

图1 单因素优化试验Fig.1 Single factor optimization test

2.1.2 正交试验 从正交试验结果表1中可见，C因素 （R=1.916） 为主要因素，A 因素为次要因素（R=1.631），B 因素（R=10.763）作用较小，在试验过程中的影响因素较小。从图2的响应曲线图得出温度、时间、添加量3 个因素的变化趋势，与之前单因素的试验结果吻合。优化水平分别为A2：80 ℃，B2：30 min，C2：2 mL；最优的试验组合为组4：A2B1C2（13.961 mg/100 g），试验条件为80 ℃下加入氢氧化钾乙醇溶液2 mL，反应20 min。

表1 L9（34）正交试验设计与结果Table1 Design and results of L9（34） orthogonal test

表2 方差分析Table2 Analysis of variance

图2 胆固醇及胆固醇氧化物标品的液相色谱图Fig.2 Liquid chromatography of cholesterol and cholesterol oxides

2.1.3 最佳工艺验证试验 准确称取1 g 样品，平行样3 份，按最佳工艺条件皂化（80 ℃下加入氢氧化钾乙醇溶液2 mL，反应20 min）、提取，胆固醇质量浓度分别为13.872，13.798，13.921 mg/100 g，说明该皂化条件稳定可行。

2.2 HPLC 方法验证

2.2.1 专属性试验 25-脱氢胆固醇、7-脱氢胆固醇和胆固醇在液相色谱中保留时间分别为5.403，8.281，15.803。25-脱氢胆固醇和7-羟基胆固醇的分离度为18.366（R＞1.5），7-羟基胆固醇和胆固醇分离度29.778（R＞1.5）。说明25-脱氢胆固醇、7-羟基胆固醇和胆固醇的分离度很好。

2.2.2 标准曲线的绘制及线性关系 以胆固醇峰面积为纵坐标，胆固醇、25-羟基胆固醇和7-脱氢胆固醇质量浓度为横坐标，绘制胆固醇标准曲线。胆固醇标准曲线：y=5468.3x+22.612，线性范围0.0967～0.9959 mg/mL，R2=0.99989。7-脱氢胆固醇标准曲线为：y = 20696x - 107.75，线性范围：0.0120～0.2011 mg/mL，R2= 0.9996；25-羟基胆固醇：标准曲线y = 3308.7x - 21.53，线性范围：0.1237～0.1998 mg/mL，R2=0.9992。

2.2.3 精密度试验 结果表明，牛奶中胆固醇的含量平均值为13.054 mg/100 g，RSD 为0.619%，RSD＜2%。试验结果表明，该色谱分析条件具有很高的精密度。结果如表3所示，成熟乳中7-脱氢胆固醇平均值为0.873 mg/100 g，RSD 为3.562%，RSD＞2%，25-羟基胆固醇平均值为1.19 mg/100 g，RSD：1.696%，RSD＜2%，试验结果表明该色谱条件定量胆固醇氧化物具有一定的精密度。

表3 胆固醇及COPs 精密度试验结果Table3 Experimental results of cholesterol and COPs precision

2.2.4 回收率试验 该方法胆固醇的回收率在99.2%～101.2%，平均回收率为99.5%，7-脱氢胆固醇的平均回收率为47.4%，25-羟基胆固醇的平均回收率为67.6%。说明该方法在简便易行的基础上，还能有较高的回收率，基本可以完全提取样品中的胆固醇，准确性高，稳定性强，样品中的COPs含量较低，回收率相对较低。可能是由于25-羟基胆固醇含有一个羟基，7-脱氢胆固醇中含有一个羰基。都属于极性基团，水溶性大，不利于物质的回收。

表4 胆固醇及COPs 回收率试验结果Table4 Experimental results of cholesterol and COPs recovery

2.2.5 稳定性试验 试验结果表明，牛奶中胆固醇含量的平均值为13.470 mg/100 g，RSD：0.545%，RSD＜2%；25-羟基胆固醇含量的平均值为0.910 mg/100 g，RSD 为1.248%，RSD＜2%；7-脱氢胆固醇含量的平均值为1.088 mg/100 g，RSD：2.798%，RSD＜2%，通过该方法提取的胆固醇具有很高的稳定性，测定胆固醇的含量基本没有变化。25-羟基胆固醇和7-脱氢胆固醇相对于胆固醇含量有差异。

2.2.6 重现性试验 结果见表6，牛奶中胆固醇的含量平均值为13.085 mg/100 g，RSD 为1.105%，RSD＜3%，该试验结果表明本方法的重现性较好。7-脱氢胆固醇含量平均值为1.133 mg/100 g，RSD为1.446，RSD＜3%，25-羟基胆固醇含量平均值为0.885 mg/100 g，RSD 为5.284，RSD＞3%，结果表明该方法测定胆固醇氧化物的重现性较胆固醇的差，分析原因主要由于样品中的含量太低，存在一定的差异性。

表5 胆固醇及COPs 稳定性试验结果Table5 Test results of cholesterol and COPs stability

表6 胆固醇及COPs 重现性试验结果Table6 The experimental results of cholesterol and COPs reproducibility

2.3 几种乳制品和母乳中胆固醇和胆固醇氧化物的含量

根据上述所得的胆固醇皂化和液相方法，本试验测定了13 种品牌的奶制品，通过分析可得，13 种奶制品中伊利纯牛奶中的胆固醇含量最高（13.342 mg/100 g），其 次 是 蒙 牛 纯 牛 奶（12.159 mg/100 g），阳光纯牛奶（11.160 mg/100 g），伊利和阳光纯牛奶存在显著性差异（P＜0.05）。母乳中，成熟乳中胆固醇的含量（9.371 mg/100 g）显著（P＜0.05）低于初乳胆固醇含量（10.967 mg/100 g），试验测得的母乳胆固醇含量均在文献报道范围内4.30～21.77 mg/100mL[21-22]。酸奶中，阳光原味酸奶的胆固醇含量最高（10.674 mg/100 g），而蒙牛原味酸牛奶的胆固醇含量最低（8.912 mg/100 g）。结果表明，不同品牌的纯牛奶之间胆固醇含量也存在一定差异，主要因为奶牛个体间差异和奶源不同等因素导致。不同品牌的酸牛奶中的胆固醇含量也存在差异，主要由于奶源差异，以及所采用菌种类型不同，不同菌种降胆固醇效果不一样[23-27]。随着哺乳时间变化，母乳中的胆固醇含量也发生一定变化。母乳中的胆固醇含量 （初乳10.967 mg/100g，成熟乳9.371 mg/100 g）与冲配后婴儿配方奶中的胆固醇含量 （一段10.552 mg/100 g，二段10.718 mg/100 g，三段11.399 mg/100 g）相近，因此配方奶粉的胆固醇的添加量主要参考母乳中胆固醇的数据，更有利于婴儿身体健康。市售的奶制品中均未检测到胆固醇氧化物，只在母乳样品初乳和成熟乳中分别检测到较少量的胆固醇氧化物（COPs＜2 mg/mL），与文献中的报道结果相符[20]，其中初乳中7-脱氢胆固醇的含量为0.395 mg/100 g，25-羟基胆固醇0.819 mg/100 g；成熟乳中的7-脱氢胆固醇的含量为0.895 mg/100 g，25-羟基胆固醇1.146 mg/100 g。且母乳中的初乳和成熟乳中的7-脱氢胆固醇含量具有显著性差异（P＜0.05），而25-羟基胆固醇随着泌乳期变化没有显著性差异。

表7 几种奶制品和母乳中胆固醇和胆固醇氧化物的含量Table7 The content of cholesterol and oxidized cholesterol in several dairy products and human milk

3 结论

本试验通过胆固醇的皂化时间、 温度和皂化试剂添加量的单因素优化试验，以及正交试验和验证试验。得到了适合液态乳胆固醇皂化最佳条件为1 mL 液态乳80 ℃下加入2.0 mL KOH 乙醇溶液皂化20 min。并且，本试验验证了同时测定乳中胆固醇、7-脱氢胆固醇和25-羟基胆固醇的含量的高效液相色谱法。该色谱条件下测定，胆固醇、7-脱氢胆固醇和25-羟基胆固醇的分离度分别为29.78，18.37（分离度＞1.5）。胆固醇、7-脱氢胆固醇和25-羟基胆固醇线性范围分别为0.0967～0.9959 mg/mL （R2=0.9999）、0.0120～0.2011 mg/mL（R2=0.9996）和0.1237～0.1998 mg/mL（R2=0.9992）；平均回收率分别为99.5%，67.6%，47.4%。该方法大大的减少了皂化试剂的用量和皂化时间，节约了样品用量，且采用液相色谱方法同时测定乳中胆固醇、7-脱氢胆固醇和25-羟基胆固醇的含量，具有较好的稳定性、重现性和回收率。