11种中药对致犊牛腹泻大肠杆菌的体外抑菌试验

胡安古丽·努尔别克 ， 赛福丁·阿不拉 ， 那尔胡兰·再肯 ， 布合丽倩穆·依明 ，马凯琪 ， 陈 凯 ， 陈雪珂 ， 德力拜尔

(新疆农业大学动物医学学院 ， 新疆 乌鲁木齐 830052)

犊牛腹泻是危害犊牛的常见疾病之一，该病一年四季均可发生，尤其哺乳期的犊牛更容易发生腹泻，且发病率高，严重地影响奶牛产业的健康发展，被称为新生犊牛的杀手[1-3]。而导致犊牛腹泻的原因很多，其中大肠杆菌是犊牛腹泻的主要原因之一。大肠杆菌作为肠道菌群的重要组成部分，一般是非致病的，但是一些特殊血清型的大肠杆菌可导致家畜的腹泻及败血，早在 1955年Scholfield等就发现某些大肠杆菌对家畜具有致病性[4]。1967年 Kolher、Smit等指出，产肠毒素大肠杆菌(EnterotoxigenicEscherichia.coli,ETEC)是引起幼畜腹泻的主要致病菌[5]。Levine和Osel分别在1987年和1992年证明ETEC是导致幼畜腹泻的重要原因[6-7]。随着国内养殖业的发展，致病性大肠杆菌对我国畜牧业的损害也日益明显[8]。高睿等[9]在2008年对陕西部分地区腹泻犊牛进行病原学检测，发现ETEC为主要致病菌。方光远等在2014年通过分析南京地区奶牛场犊牛腹泻原因，证明该地区犊牛腹泻是由大肠杆菌引起的[10]。

最近的研究普遍认为，大肠杆菌容易产生耐药性且变化快，耐药频率也随着时间的推移显著提升，耐药谱范围变得更加广泛，对常用的抗生素已经广谱耐药[11]。天然药物具有较好的抑制犊牛腹泻致病菌的作用，何博等[12]在中国知网进行检索发现，关于犊牛腹泻的论文就有1 548篇，其中应用中药治疗犊牛腹泻的有64篇，绝大部分都取得了一定的疗效。Subhadra等[13]使用石龙尾属甲醇提取物对抗志贺菌和抗酸活性进行研究，证明100 mg/kg·bw的最低剂量对大鼠腹泻模型治疗效果比洛哌丁胺明显(P<0.01)，被证明是一种抗菌性的止泻剂。本试验以中药的抗菌、抗毒素、抗病毒、补充营养、免疫调节、提高生产性能等作用为突破口，研究11种中药(大黄、石榴花、红花、阿魏、小檗实、没食子、骆驼缝子、石榴皮、柽柳实、黄连和甘草)对致犊牛腹泻大肠杆菌体外抑菌作用，为治疗犊牛腹泻大肠杆菌病提供参考和依据。

1 试验材料与方法

1.1 中药 大黄、石榴花、红花、阿魏、小檗实、没食子、骆驼蓬子、石榴皮、柽柳实、黄连、甘草，以上药物均购自新疆维吾尔自治区民族医院。

1.2 培养基 MH肉汤培养基、营养琼脂培养基等购自新疆鼎枫生物科技有限公司。

1.3 菌种 致犊牛腹泻大肠杆菌由新疆农业大学动物医学学院中兽医药研究室提供。

1.4 试验方法

1.4.1 中药提取液的制备 水提醇沉法：将骆驼蓬子、没食子、小檗实等11种中药材，干燥、粉碎，称取30 g，每次加10倍水煎煮2 h、重复3次，过滤，滤液减压浓缩至75 mL，加入95%乙醇后总体含量达到70%，搅拌后置于4 ℃冰箱过夜，3 000 r/min离心5 min，取上清液减压回收乙醇后，再加95%乙醇使总体含量达到80%以上，然后再置于4 ℃冰箱过夜，过滤，减压回收乙醇，调pH值到7.0±0.2，成原液浓缩1 g/mL，用无菌过滤器过滤药液，分装于无菌管中，4 ℃冰箱保存备用[14]。

1.4.2 大肠杆菌悬液的制备 活化后的大肠杆菌接种于营养琼脂平板，37 ℃培养18-24 h后，挑取单菌落接种至肉汤中，37 ℃培养18-24 h，平板计数法计数，用无菌生理盐水稀释至103～107CFU/mL备用。

1.4.3 体外抑菌试验 采用打孔给药法：灭菌棉签将稀释的菌液均匀涂抹营养琼脂平板，用6 mm无菌打孔、封底。每孔加入不同的药液100 μL，每种药物重复3次，置于恒温培养箱中在37 ℃条件下，培养18-24 h，用游标卡尺测量抑菌圈直径。

采用牛津杯法：将牛津杯放置已铺好菌的琼脂平皿上，每平皿放6个杯，每个杯加入100 μL的药液，每种药物重复3次，37 ℃培养18-24 h，用游标卡尺测量抑菌圈直径。

判断标准：抑菌圈直径≥20 mm为极敏，抑菌圈直径在15～19 mm为高敏，抑菌圈直径在10～14 mm为中敏，抑菌圈直径<10 mm为低敏，无抑菌圈为耐药[15]。

1.4.4 MIC和MBC的测定 最低抑菌浓度(MIC)的测定：取装有灭菌肉汤培养基1 mL的试管12支，第1支试管加入灭菌处理的药液1 mL(1 g/mL)，混匀后吸取1 mL置第2试管，以此类推，直到第9管吸取1 mL弃去，第10管只加菌不加药物作为对照管，第11管只加肉汤培养，第12管中加受试药液1 mL，然后取10 μL的供试菌分别加入1～12管中，摇匀后放入37 ℃恒温培养箱中，并观察结果。

最低杀菌浓度(MBC)的测定：所有无细菌生长的试管中取20 μL的肉汤，划线接种于琼脂平板上，37 ℃培养18 h，平板上菌落生长数小于3个对应的最低药物浓度作为MBC[16]。

2 结果与分析

2.1 11种中药提取物对致犊牛腹泻大肠杆菌敏感性的测定 结果见表1。从表1结果可见，牛津杯法的结果和琼脂平板打孔法的结果基本一致，但各种中药提取物对致犊牛腹泻大肠杆菌的抑菌效果各不相同，石榴花、红花、阿魏、柽柳实和甘草对致犊牛腹泻大肠杆菌基本无抑菌效果，大黄的抑菌效果较低，小檗实和黄连对致犊牛腹泻大肠杆菌抑菌效果为高度敏感，其中骆驼蓬子和没食子的抑菌效果较明显，抑菌圈达到25.63 mm、21.89 mm，抑菌效果最好。

2.3 11种中药提取物(MIC)和(MBC)的测定 由表2可知，11种不同中药提取物对致犊牛腹泻大肠杆菌抑菌活性不同。骆驼蓬子和没食子对致犊牛腹泻大肠杆菌的抑制效果较好，MIC值3.91 mg/mL、31.25 mg/mL，MBC值为7.812 5 mg/mL、62.5 mg/mL；小檗实和黄连MIC值均为62.50 mg/mL，MBC值均125 mg/mL；石榴皮和大黄MIC值均为125 mg/mL，MBC值均250 mg/mL，结果见表2。

表1 11中药的提取物对致犊牛腹泻大肠杆菌的打孔法测定

++++: 极敏; +++:高敏; ++:中敏; +:低敏; -:无效果
抑菌圈直径包括孔径直径。抑菌圈直径包括牛津杯直径。

表2 6中药提取物对大肠杆菌的MIC和MBC测定

3 讨论

犊牛腹泻大肠杆菌病是奶牛生产及畜牧业中经济损失较高的最常见的一种病，发病率高，且血清型多，不同血清型对药物的敏感性不一致。本试验对11种中药提取液的体外抑菌试验发现，骆驼蓬子、没食子对犊牛腹泻致病菌有较好的抑菌作用，黄连、石榴皮、小檗实和大黄的抑菌效果次之，而红花、阿魏、石榴花、柽柳实、甘草等5种中药的提取物对致犊牛腹泻大肠杆菌没有表现出抑菌效果。向双云等对黄芩、黄连、黄柏、鱼腥草等8 种中草药检测对大肠杆菌的抑制作用，结果发现，黄连、鱼腥草、五味子和艾草对大肠杆菌的抑菌效果最强，与本试验结果相似，出现这种结果的原因可能与药物成分有关，黄连的抑菌成分一般是小檗碱，具有广泛的抑菌作用[17]。南苹瑶等检测14味中药乙醇提取物体外抗大肠杆菌活性，发现70%乙醇提取获得的丁香、黄连、山楂、黄柏和大黄提取物对大肠埃希菌抑菌直径为21.5mm、23.5mm、23.0mm、21.5mm、21.5mm，大黄的抑菌效果优于本试验中大黄对犊牛腹泻大肠杆菌的抑菌效果[18]。常婧等研究表明，甘草为原料用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、95%乙醇和水等不同极性的溶剂进行提取，以金色葡萄球菌和大肠杆菌进行体外抑菌试验，发现这不同极性成分的物质对两种菌均有一定的抑菌效果，这与本试验结果不符[19]。造成这一系列差异的原因可能与药物来源、质量、提取方法、大肠杆菌血型及药物浓度有关。

此外，本试验中发现骆驼蓬子对致犊牛腹泻大肠杆菌有较好的抑菌作用，抑菌直径及MBC分别为：25.63 mm、7.81 mg/mL。相关文献报道复方骆驼蓬子油对绿脓杆菌、大肠杆菌、金色葡萄球菌有一定的抑菌作用[20]。其抑菌作用可能与骆驼蓬的β-Carboline骨架有关，有待进一步研究。