枳椇子含药血清对酒精性肝损伤的抗氧化作用

黄 劲 ， 高 霄 ， 雷依丽 ， 胡 婷 ， 康颖倩 ， 覃容贵

(1. 贵州医科大学基础医学院 ， 贵州 贵阳 550025 ； 2. 贵州医科大学 环境污染与疾病监控教育部重点实验室 ，贵州 贵阳 550025 ； 3. 贵州医科大学药学院 ， 贵州 贵阳 550025)

酒精性肝病(Alcoholic liver disease, ALD)是因长期过量饮酒引起的一种肝脏疾病。在西方国家，ALD是导致肝病患者肝硬化的主要原因[1]。在我国，近年来ALD的发病率呈上升趋势，成为继病毒性肝炎之后导致肝损害的第二大肝病[2]。早期病理改变为肝细胞氧化损伤，初期常表现为脂肪肝，可进展成酒精性肝炎、酒精性肝纤维化，若进一步发展成酒精性肝硬化，则难以逆转，严重危害人民健康[3]。因此，寻找消除或降低酒精对人体伤害的有效药物一直是国内外研究的热点，尤其在发病初期进行抗氧化干预，使机体免受损伤具有重要的意义。

枳椇子(HoveniadulcisThunb，HDT)为鼠李科拐枣属植物枳椇的带有肉质果柄的果实或干燥成熟种子[4]，《中药大辞典》等规定其药用部位为带肉质膨大花絮轴的果实和种子。主治酒醉，烦热，口渴、二便不利等症[5]。本研究以人LO2细胞为研究对象，采用酒精诱导复制肝损伤细胞模型，通过观察细胞活力和检测生化指标等，来评价枳椇子含药血清对酒精诱导肝细胞损伤的保护作用，并进一步探讨其作用机制，为酒精性肝损伤的预防和治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物与细胞 清洁级雄性SD大鼠16只，质量200～250 g，由贵州医科大学动物实验中心提供，许可证编号：SCXK(京)2014-0004；LO2人肝细胞株，由贵州医科大学环境污染与疾病监控教育部重点实验室提供。

1.2 药材与试剂 枳椇子为鼠李科Rhamnaceae植物枳椇HoveniadulcisThunb的干燥成熟带肉质的果实或种子，购自遵义药材批发市场，经贵州医科大学药学院覃容贵教授鉴定为优质药材。胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；DMEM培养液、PBS缓冲液和0.25%胰蛋白酶溶液(Hyclone公司)；青-链霉素混合液(Gibco公司)；MTT、DMSO(北京索莱宝科技有限公司)；ALT、AST、SOD、MDA和总蛋白测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3 仪器 台式冷冻离心机(美国Beckman公司)；电热恒温水浴箱(天津泰斯特仪器有限公司)；-80 ℃冰箱(青岛海尔特种电器有限公司)；生物安全柜(北京东联哈尔仪器制造公司)； CO2细胞培养箱(美国Thermo公司)；超纯水系统(德国默克密理博公司)；超声破碎仪(宁波荣顺科技仪器厂)；多功能酶标仪(美国Bio-TEK公司)。

1.4 方法

1.4.1 枳椇子水提液的制备 取枳椇子250 g加蒸馏水(料液比1∶6)，煎煮2次，第1次煎煮1.5 h，过滤，滤渣再煎煮1 h，滤过，合并滤液，浓缩至250 mL，相当于1 g生药/mL。

1.4.2 含药血清制备 动物适应性喂养7 d后，随机分为2组，即空白组(0.9% NaCl)、枳椇子组(1 g/mL 枳椇子水提液)，禁食不禁水12 h后，按照1 mL/100 g 体重灌胃，每天1次，连续7 d。于末次灌胃2 h后，用乙醚麻醉动物，在无菌条件下，用无菌采血针心脏采血，收集于不含抗凝剂的真空采血管内，血液室温静置1 h后，3 000 r/min，4 ℃，离心15 min，取血清，将同组大鼠血清混匀，56 ℃水浴灭活30 min后，过0.22 μm滤器除菌，即为枳椇子含药血清和空白血清，分装于无菌EP管中，-80 ℃冰箱保存备用。

1.4.3 细胞培养 LO2细胞用高糖DMEM培养液(含10%胎牛血清，1%双抗，以下简称“完培”)，于37 ℃，5% CO2培养箱中培养。将对数生长期细胞传代，适时进行指标检测。

1.4.4 肝损伤细胞模型的最佳酒精浓度的测定 将贴壁率达80%的细胞用“完培”配制成5×104个/mL的细胞悬液，接种于96孔板，每孔100 μL。试验设正常组、不同浓度酒精组，每组设6个重复孔。24 h后无细胞孔设为调零孔，调零孔和正常组加入“完培”，酒精组各组的终浓度分别为25、50、100、200、400、800 mmol/L，继续培养24 h后，去培养液，各孔加入100 μL 0.5 mg/mL的MTT，37 ℃孵育4 h，去上清液，各孔加入150 μL DMSO，于490 nm处在酶标仪上检测吸光度值。按公式计算细胞存活率(%)=(A酒精组/A正常组)×100%(以调零孔调零)。试验重复3次，计算不同酒精浓度下肝细胞存活率。

1.4.5 含药血清对酒精损伤LO2细胞存活率的影响 将传代培养好且贴壁率达80%的细胞以5×104个/mL的密度接种于96孔板中，每孔100 μL。试验设调零孔、正常组、模型组、空白血清组、3个不同浓度含药血清组，每组设6个重复孔。37 ℃培养24 h后调零孔、正常组加入“完培”(10 μL/孔)，空白组加入空白血清(10 μL/孔)，给药组依次加入含药血清(10 μL/孔)，使终浓度分别为2.5%、5%、10%。37 ℃培养2 h后，调零孔和正常组加入“完培”(10 μL/孔)，其余各组加入酒精(10 μL/孔，其终浓度为1.4.4中确定的最佳酒精浓度)。37 ℃培养24 h后，MTT法(参照1.4.4)检测细胞存活率。按公式计算细胞存活率(%)=(A含药血清组/A正常组)×100%(以调零孔调零)，试验重复3次。

1.4.6 ALT、AST、SOD、MDA含量测定 细胞分别接种于48孔板和6孔板，37 ℃培养，试验设正常组、模型组、空白血清组、3个不同浓度含药血清组，取培养液测ALT和AST(48孔板)；收集细胞测定MDA和SOD(6孔板)。具体步骤参照试剂盒说明书操作，试验重复3次。

2 结果

2.1 肝细胞损伤模型最佳酒精浓度的确定 结果显示，酒精终浓度分别为25、50、100、200、400 mmol/L和800 mmol/L 时，肝细胞的存活率分别为78.87%、72.97%、66.49%、53.72%、38.60%、16.22%，见图1。与正常组比较，各酒精处理组的存活率显著降低，差异显著(P<0.05)。本试验选择细胞死亡率为50%左右的酒精浓度，即200 mmol/L作为后续建模浓度。

图1 不同浓度酒精对LO2细胞存活率的影响
#：与正常组比较 ，P<0.05

2.2 MTT法检测含药血清对酒精损伤LO2细胞存活率的影响 模型组肝细胞存活率为55.30%，与正常组比较，存活率明显减小(P<0.05)。空白血清组，2.5%、5%、10%含药血清组细胞存活率分别为56.86%、58.15%、67.61%、64.48%。空白血清组与模型组比较，差异不显著(P>0.05)；与空白血清组比较，含药血清组中5%和10%剂量组的存活率差异极显著或显著(P<0.01或P<0.05)，见图2。

图2 枳椇子含药血清对酒精损伤LO2细胞存活率的影响
#：与正常组比较，P<0.05；*，**：与空白血清组比较，P<0.05或P<0.01

2.3 含药血清对酒精损伤细胞ALT 、AST、SOD和MDA含量的影响 与正常组比较，模型组ALT、AST和MDA含量明显增高，而SOD酶活性明显降低(P<0.01)；与空白血清组比较，5%剂量含药血清组ALT含量显著降低(P<0.05)；5%和10%含药血清组AST含量极显著低于空白血清组(P<0.01)；各剂量含药血清组，SOD活性均升高，MDA含量均下降，差异显著或极显著(P<0.05或P<0.01)，见表1。

表1 枳椇子含药血清对酒精损伤LO2细胞ALT、AST、SOD和MDA含量的影响

##：与正常组比较，P<0.01； *，**：与空白血清组比较，P<0.05或P<0.01

3 讨论

血清药理学是指将一种含药血清施加于体外试验反应体系，用于研究药物，尤其是中药和复方药药效及药理的试验技术方法[6-7]。其中“含药血清”，是指动物经口服或灌胃给予一定剂量药物之后，经过一段时间连续给药处理后，收集血液，经离心后所得到的血清。血清药理学方法自1986年日本学者Hiroko Iwama首次提出后[8]，经过多年的努力和改进，已经被广大学者所接受，并成为研究中药药效的有效方法。较之将生药直接加入试验体系的传统药理学而言，该方法能较好地反映药物的药效，有助于研究中药药效物质及其在体内的代谢过程[6]。因此，本试验采用血清药理学方法制备枳椇子含药血清，在细胞水平上探讨枳椇子对酒精性肝损伤的保护作用及其机制。

枳椇子作为古老的醒酒解酒药食两用植物，被历代医生所用。本试验利用200 mmol/L酒精处理LO2细胞，构建了人酒精性肝损伤细胞模型，采用临床上常见生化指标ALT 和 AST评价肝损伤程度和预后效果。结果显示，模型组ALT和AST活力分别为(21.12±3.671)U/L和(36.41±3.533)U/L，与正常组(5.66±1.273)U/L和(13.24±3.083)U/L比较，模型组ALT和AST活力均显著增加，但预先用枳椇子含药血清处理的各剂量含药血清组均能抑制酒精所造成的转氨酶活性升高，其中5%含药血清组ALT和AST活力分别为(8.097±2.514)U/L和(19.10±1.442)U/L，极显著降低了转氨酶活性。本试验数据提示，提前给予枳椇子处理对急性酒精性肝损伤具有保护作用。

越来越多的研究显示，酒精暴露对肝脏损伤的机制中，氧化应激在酒精性肝病发生发展中起着重要作用[9]。氧化应激是机体内高活性分子产生过多，如活性氧(Reactive oxygen species, ROS)和活性氮自由基(Reactive nitrogen species, RNS)等，超出机体清除氧化物的能力，从而导致氧化系统和抗氧化系统失衡的一种应激状况[10]。进入体内的酒精，大部分(>90%)需在肝脏中代谢，包括细胞质的酒精脱氢酶系统、微粒体的酒精氧化系统和线粒体的乙醛脱氢酶等[11]，在经上述途径将酒精转化为CO2和H2O的过程中，都会产生ROS。ROS能够与生物大分子反应造成蛋白质和酶变性失活、DNA结构改变、生物膜脂质过氧化，从而造成细胞损伤。正常情况下，机体内含有多种清除ROS的酶或抗氧化物质，如SOD、GSH、维生素E、维生素C等，但大量酒精的摄入，机体内产生过多ROS，无法被抗氧化物质完全清除时，会导致氧化应激，过度的ROS可启动脂质过氧化反应，导致终产物丙二醛(MDA)等增多，SOD等活性下降，最终导致线粒体膜损伤，肝细胞受损[12]。本试验显示，与正常组(1.413±0.243 4)nmoL/mg MDA含量和(56.32±3.655) U/mg SOD酶活力相比，模型组LO2细胞MDA含量(2.37±0.06)nmoL/mg显著增加，SOD活力(2.37±0.06)U/mg显著下降。但提前给予枳椇子含药血清处理，各含药血清组均显著抑制酒精导致的肝细胞MDA升高和SOD活性的降低，其中5%含药血清组差异尤为显著，其MDA和SOD水平分别为(1.517±0.195) nmoL/mg和(50.65±2.71)U/mg。本试验数据提示，枳椇子可能是通过上调SOD酶活性，减少氧化应激，进而发挥对酒精性肝损伤的保护作用。

综上所述，本试验结果提示，枳椇子对急性酒精性肝损伤具有预防保护作用，其作用机制可能是通过促进抗氧化酶的活性，抑制氧化应激作用来实现。