库拉索芦荟提取物对两种气单胞菌的抑菌作用

曲秀龙 , 王 利 , 李 璟

(1．西南民族大学青藏高原研究院 ， 四川 成都 610041 ； 2．西南民族大学生命科学与技术学院 ，四川 成都 610041 ； 3.成都理工大学环境学院 ， 四川 成都 610059)

库拉索芦荟(Aloebarbadensis)含有丰富的芦荟多糖、蒽酮类物质、生物活性酶等多种活性成分，具有美容、抗辐射、抗肿瘤、保护胃黏膜及肝脏的功效[1-2]，一定量的库拉索芦荟提取物的抑菌消炎功能与抗生素相当，并且低毒环保不会使细菌产生抗药性[3-4]。库拉索芦荟兼具药用与食用价值，是我国唯一可用于食品生产加工的芦荟品种。且易于种植，来源广泛，可作为饲料改善鸡、猪、牛等养殖动物的生产性能，具有很强的经济效益[5]。

嗜水气单胞菌(AeromonasHydrophila)是弧菌科气单胞菌属的条件致病菌，其致病菌株的致病动物群体广泛[6]。对于淡水养殖业，嗜水气单胞菌引起的细菌性败血症危害范围大，流行季节长，是鱼源致病气单胞菌中造成经济损失最大的病菌[7]。维氏气单胞菌(Aeromonasveronii)是另一种常见的致病弧菌科气单胞菌，易引起鱼类的败血症和鱼体溃疡综合征。随着渔业的发展，抗生素被大量使用，气单胞菌的耐药性也日趋严重[8]。为缓解气单胞菌的耐药性，开发中药提取物作为抗生素的替代品刻不容缓。

本次试验检测了库拉索芦荟对嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小灭菌浓度(MBC)，并比较库拉索芦荟与各种抗生素对维氏气单胞菌的抑菌效果，通过分析库拉索芦荟治疗嗜水气单胞菌攻毒鲫鱼的数据，本次试验对开发抗生素替代品治疗气单胞菌的感染进行了初步探索。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 1年龄库拉索芦荟购自成都花卉市场，经专家鉴定为库拉索芦荟；供试嗜水气单胞菌(菌株编号：AeH0627)、维氏气单胞菌(菌株编号：AeV0624)分离自体重120 g的患病鲫鱼肝脏，由西南民族大学生命科学与技术学院实验室保存和提供；鲫鱼，购自成都海鲜市场。M-H培养基和L-B培养基，购自青岛高科园海博生物技术有限公司，药敏纸片购自杭州天和微生物试剂有限公司。使用仪器有超声波破碎仪，电热恒温鼓风干燥箱，旋转蒸发仪，离心机，电热恒温培养箱等。

1.2 方法

1.2.1 库拉索芦荟的提取 剪取新鲜库拉索芦荟全叶，使用0.4%的KMnO4溶液和75%的乙醇依次消毒之后沥干，置于烘箱55 ℃干燥过夜。称取干燥芦荟100 g，于1 000 mL 75%乙醇溶液中浸泡2 h，再超声波破碎细胞75 min，真空抽滤之后用旋转蒸发仪使提取物浓缩至黑色膏状；重复上述步骤并混合2次提取物，加入无菌蒸馏水使提取物稀释至15 mL，0.45 μm过滤器过滤后紫外光下灭菌15 min，得到库拉索芦荟提取物。

1.2.2 最小抑菌浓度(MIC)的测定 按二倍稀释法，在无菌96孔深孔板中加入100 μl LB液体培养基、100 μL不同浓度的库拉索芦荟提取物和10 μL浓度为1×108CFU/mL菌液，于37 ℃ 180 r/min的摇床中培养24 h，所得的澄清组对应的最低浓度接近MIC；缩小芦荟提取物的浓度梯度，重复上述试验。所得溶液均通过镜检排除杂质的干扰，澄清组中最低浓度即最小抑菌浓度。

1.2.3 最小灭菌浓度(MBC)的测定 使用二倍稀释法，将最小抑菌浓度的澄清组溶液分别取出10 μL 接种到M-H琼脂平板上，恒温培养箱37 ℃培养24 h，所得无细菌生长组对应的最低浓度即最小灭菌浓度。

1.2.4 药敏试验(AST) 使用纸片扩散法，取多片直径0.60 cm的无菌圆滤纸片，放入最小灭菌浓度的芦荟提取物中充分浸泡24 h后紫外光下灭菌干燥。采用麦氏比浊法配备浓度1×108CFU/mL菌悬液，取出10 μL涂在LB平板上，再取滤纸片贴在含菌平板上，每个平板随机贴3片，以抗生素药敏纸片作为阳性对照，在37 ℃恒温培养箱中培养24 h后测量其抑菌圈直径。

1.2.5 攻毒与治疗试验 45尾健康鲫鱼饲喂3 d后，随机分为对照组、感染组和治疗组，其中感染组与治疗组每尾鱼均腹腔注射20 μL浓度为1×108CFU/mL的嗜水气单胞菌菌液，放入不同玻璃缸(长×宽×高：80 cm×50 cm×25 cm)中喂养。对照组及感染组不给药，治疗组经口灌服10 mL浓度为133 mg/mL的芦荟提取物，治疗5 d。第1次灌服在注射细菌后12 h，之后每12 h观察记录各组鱼的生理状况变化并统计死亡率。

2 结果与分析

2.1 MIC和MBC的测定 根据计算方法：X(MIC.MBC)=提取物mg/(提取物mL+液体营养液mL+菌液mL)，得到库拉索芦荟提取物对嗜水气单胞菌平均MIC为95 mg/mL、MBC为105 mg/mL；对维氏气单胞菌平均MIC为61 mg/mL、MBC为65 mg/mL，结果见表1。

表1 库拉索芦荟对嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌的MIC及MBC

2.2 药敏试验 药敏试验显示，库拉索芦荟提取物对嗜水气单胞菌的抑菌圈平均为10 mm，对维氏气单胞菌抑菌圈平均为16 mm。通过与抗生素药敏试验结果进行对比显示，芦荟提取物对维氏气单胞菌的抑菌效力与强力霉素、头孢曲松、红霉素、诺氟沙星和奥复星等近似。结果见表2、表3。

表2 嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌的药敏结果

表3 抗生素对维氏气单胞菌药敏结果

2.3 攻毒与治疗试验 鲫鱼在注射嗜水气单胞菌菌株AH1 10 h后，感染组与治疗组中部分鱼的眼睛和鳃盖边缘轻微充血。24 h后感染组部分鱼腹鳍充血，并开始出现死亡。随着治疗组继续给药治疗，治疗组鱼的症状减轻。60 h时，对照组出现1尾鱼死亡，但无明显嗜水气单胞菌感染症状。72 h后感染组全部死亡，治疗组基本恢复正常生理状况。结果见表4。

表4 嗜水气单胞菌AH1对鲫鱼攻毒试验结果

3 讨论

近些年，库拉索芦荟作为具有高食用和药用价值的经济作物备受养殖、制药和化妆品等行业关注。目前对芦荟提取物的抑菌作用研究显示，芦荟叶提取物的抑菌作用随浓度的增加和抑菌时间的延长而增强，热处理不会影响其抑菌效果。不同种类芦荟的提取物对同一种菌的抑菌效果不同，库拉索芦荟提取物对原核生物中的金黄色葡萄球菌抑菌作用较强，对枯草芽孢杆的抑菌作用较弱；对真核生物中的黑曲霉抑菌作用较强、对酵母菌的抑菌作用较弱[9]。不同提取物的浓度也是影响抑菌效果的主要因素，芦荟提取物的成分较复杂不易量化，建议实验前做单一成分的测试并调整提取物用量，或可使用电化学法测试库拉索芦荟浓度，检出限在2 μg左右[10-11]。

嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌是水产养殖中常见的两种条件性致病菌，抗生素的大量使用造成气单胞菌的耐药性成倍提升[12]。对鳖源嗜水气单胞菌的耐药性研究显示，嗜水气单胞菌的耐药性与不同地区的用药习惯有关，治疗前最好先做药敏测试[13]。库拉索芦荟对嗜水气单胞菌的MBC为105 mg/mL。这和艾叶、穿心莲、虎杖片对嗜水气单胞菌的MBC相近[14]。白术多糖、没食子酸等中药提取物可以有效抑制嗜水气单胞菌，但受pH值影响较严重，还未发展出成熟的技术可以应用于生产[15]。库拉索芦荟提取物对维氏气单胞菌有良好的抑菌作用，但未见与抗生素的抑菌效果进行比较[16]。本次试验测得库拉索芦荟对维氏气单胞菌的抑菌圈直径与五倍子相近。在库拉索芦荟治疗嗜水气单胞菌的攻毒试验中，治疗组的死亡率降低至20%，与其他防治措施相比，可以达到较好的治疗效果。通过蜂胶与库拉索芦荟混合物对嗜水气单胞菌攻毒尼罗罗非鱼的治疗结果可以看出，尼罗罗非鱼的存活率上升，血液参数也有显著提高[17]。鲫鱼的养殖密度大，鳞片受伤后更易被致病菌感染。芦荟中的多种活性成分也可以促进鲫鱼受伤组织处肉芽形成，加快伤口愈合，减少鲫鱼被致病菌感染的几率。库拉索芦荟皮渣是芦荟凝胶加工产生的废弃物，占芦荟鲜叶重量的50%，含有丰富的多糖和蒽醌类化合物却被大量丢弃，或可添加在养殖饲料中，增加饲料蛋白含量的同时增强鱼类免疫[18-21]。

4 结论

综合分析表明，库拉索芦荟与各抗生素对维氏气单胞菌的比对结果较好，库拉索芦荟提取物对维氏气单胞菌的抑菌效力与强力霉素、红霉素、奥复星等相当。

综上所述，库拉索芦荟提取物对嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌有较好的抑菌作用，可以用于治疗气单胞菌的感染。库拉索芦荟废渣也可能开发用作饲料，增加鱼类饲料蛋白含量，增强鱼类免疫，同时减少肠道病菌的感染。