小鼠脑内细胞色素P450 17A1神经元定位

李 强 ， 科尔沁满来 ， 李鹏辉 ， 张 雪 ， 范奎奎 ， 海日罕 ， 杜晨光,

(1.内蒙古农业大学兽医学院 ， 内蒙古 呼和浩特 010018 ； 2 内蒙古农业大学职业技术学院 ， 内蒙古 包头 014109)

中枢神经系统合成类固醇激素(如雌激素和雄激素)参与调解生殖、能量代谢及内分泌等多种功能[1]。脑内的神经元细胞、星形胶质细胞以及少突胶质细胞内均有以胆固醇为起始物类固醇激素酶类的合成，且合成过程需要一系列酶类参与，如细胞色素P450 17A1(CYP17A1)、类固醇激素合成急性调节蛋白以及3B羟基类固醇脱氢酶1在类固醇合成过程中具有积极作用[2]。

细胞色素P450超家族血红素混合功能氧化酶调节多种生理功能，包括其类似药物以及外源性物质对于激素和维生素生物合成的影响[3]。细胞色素P450 17A1是其家族中的一员，在类固醇激素合成过程中起到关键作用，调节前体物(胆固醇)转化为盐皮质激素、糖皮质激素或性激素等，同时也是具有多重性功能的酶，可催化17α羟基化反应以及17,20裂解反应[4]。

由于CYP17A1可催化类固醇激素的合成及代谢，因而在目前的许多研究中都将其作为治疗类固醇激素相关疾病的关键点，涉及内分泌紊乱、肥胖、以及肥胖引发的高血压、糖尿病等[5]。有文献证实CYP17A1可间接影响脑内其他蛋白的表达，从而调节相应生理功能[6]，提示CYP17A1与类固醇激素参与中枢神经系统功能。目前研究主要集中在睾丸、卵巢、肾上腺等组织，鲜有CYP17A1在脑内有表达的报导。为此，本试验检测了小鼠脑组织内CYP17A1神经元分布，为研究其在中枢神经系统可能存在功能提供神经学证据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 C57BL/6小鼠，购自北京维通利华生物科技有限公司，经自群繁育后(避免近交)，获得适应现有饲养条件的7周龄雄性小鼠(n=6),体重23～25 g。

1.2 方法

1.2.1 组织获取和保存 用于免疫荧光试验的小鼠(n=6)经3 %戊巴比妥钠深度麻醉，使用灌注泵经心肺以3 mL/min灌注5 min生理盐水约15 mL，后分别以5 mL/min灌注固定液(4 %多聚甲醛)40 min约200 mL，取各组小鼠脑组织置于固定液中后固定过夜，修块后转移至30 %蔗糖溶液中直至完全沉降。使用冰冻切片机对脑组织冠状面连续切片，厚度为30 μm，漂片法洗涤，4 ℃保存，并加入叠氮化钠(NaN3)防腐。

1.2.2 免疫荧光 使用冰冻切片机包埋剂(OCT，SLEE)包埋脱水后的脑组织，于冰冻切片机(SLEE MNT)连续切片，厚度为30 μm，按顺序置于0.02 mol/L PBS(pH值=7.4)的12孔板内。选取不同位置脑片经(1%triton+0.4%SDS+PBS) 4 ℃摇床(80 r/min)预处理4 h。3%标准驴血清(NDS)室温(29 ℃)封闭1 h，4 ℃过夜孵育一抗(CYP17A1，兔单克隆，1∶200，Abcam ab125022)、然后室温孵育二抗2 h (ALexa647, 驴抗兔；1∶2 000, Abcam ab150075)。每步结束后用PBS清洗3次，每次10 min。然后将切片整齐的贴于载玻片，待其完全干燥后，激光共聚焦(Nikon C2)647波段进行扫描。

2 结果

CYP17A1荧光信号存在于小鼠脑内特定神经核团，呈广泛性分布。根据小鼠脑3D图谱并结合小鼠脑立体定位图谱(见中插彩版图1A-D)， CYP17A1在小鼠脑内各区域的分布如下。

前脑：CYP17A1荧光信号形态清晰饱满，集中分布在内脏区(VISC，见中插彩版图1J)、躯体感觉区(SSs，见中插彩版图1H)，在主要体觉区(SSp，见中插彩版图1H)、海马、丘脑室旁核(PVT，见中插彩版图1G)、脾后区(RSP)等处有零散分布，其他区域未见表达。

下丘脑区：CYP17A1荧光信号在下丘脑室旁核(PVN，见中插彩版图1F)、下丘脑腹内侧核(VMH，见中插彩版图1L)处呈明显区域性分布。下丘脑外侧区(LHA，见中插彩版图1K)有较为分散的阳性信号。其他区域亦见零星分布(见中插彩版图1E-L)。

后脑脑干：CYP17A1荧光信号在蜗腹侧核后部(VCO，见中插彩版图1T)、蓝斑(LC，见中插彩版图1N)、舌下神经核(12N，见中插彩版图1V)、外侧网状核(LRNm，见中插彩版图1X)中有丰富表达。巨细胞网状核(GRN，见中插彩版图1O/P)、臂旁核(PB，见中插彩版图1R)等核团中亦见少量零散分布(见中插彩版图1M-X)。

图1 小鼠脑内CYP17A1荧光信号的分布小鼠脑形态模拟图(A-D)，下丘脑室旁核(PVN, E,F)，下丘脑腹内侧核(VMH, L),下丘脑外侧区(LH, I,K)，内脏区(VISC, I,J)，

3 讨论

目前未见小鼠脑内CYP17A1神经元分布的报道。本试验检测了CYP17A1在小鼠脑内的分布，结果表明，CYP17A1神经元在小鼠脑内多个核团均有表达，如下丘脑的PVN、VMH、LHA核团及脑干内的LC、NTS、12N等区域均检测到CYP17A1神经元分布。上述区域与已报到的类固醇类激素或受体的分布吻合，推测CYP17A1可能在这些区域内调节类固醇激素的合成及其功能的发挥。

中枢神经系统存在着各类细胞集合而成的大量核团和神经纤维，可接收来自机体各处信息，通过下丘脑-垂体-性腺轴反馈作用进而调节机体的内分泌活动。类固醇类激素(如雌激素及雄激素)在调节生殖及能量代谢平衡中发挥重要作用，睾酮可在CYP17A1等酶的作用下转化为雌二醇。啮齿类及灵长类动物脑中有雌二醇和睾酮及其受体的广泛分布，雌激素受体(ER)及雄激素受体(AR)被认为是细胞对雌激素和雄激素应答的媒介。雌激素受体主要分布在间脑视前区、中脑间核及下丘脑的弓状核、室旁核、腹内侧核，雌二醇作为主要的雌激素与其受体结合后，可降低母鸡的产蛋量、蛋的受精率及公鸡的产精能力[7]；在去势大鼠脑组织中雌二醇可影响G蛋白偶联雌激素受体的表达[8]；雄激素受体主要分布在丘脑内包括弓状核、腹、背侧核和室旁核等处，睾酮与雄激素受体结合对机体产生一些列调控作用，包括可直接通过下丘脑-垂体轴调节垂体中黄体生成素和卵泡刺激素的释放[8]。

同时CYP17A1在体内的表达亦受多种因素的调节，如食欲素B影响猪子宫中CYP17A1的表达、敲除Mamld1可减少小鼠睾丸肿瘤细胞中CYP17A1的表达、蛋白激酶C在肾上腺中可抑制CYP17A1的表达[9]。提示通过调节特定区域中CYP17A1的活性，可对生殖、内分泌及某些疾病的预防和治疗起到积极意义。

综上，结合类固醇激素在脑内核团中的作用，推测CYP17A1在小鼠脑内与调节相关类固醇激素合成及功能的发挥积极相关。